橘小实蝇生殖系统细菌分子多态性及引诱性研究

论文摘要

橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）是我国一种重要的毁灭性果蔬害虫,隶属于双翅目（Diptera）、实蝇科（Tephritidae）、果实蝇属（Bactrocera Macquart）,严重为害40多个科250多种水果和蔬菜,食性杂、繁殖力强、传播快、危害大,防治困难,被世界各国列为水果“头号杀手”。本文通过PCR-DGGE技术研究橘小实蝇雌雄成虫生殖系统内的细菌群落,在此基础上,采用德国生物梅里埃公司的API20E试剂盒鉴定橘小实蝇雌性生殖系统内的可培养细菌并分析其发酵液的引诱活性,最终为了解该昆虫与微生物的协同进化关系和利用微生物防治此类害虫提供新的思路和科学依据。本文的主要研究结果如下：1从橘小实蝇雌性生殖系统中共分离得到属β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和放线菌纲（Actinobacteria）5个不同的细菌纲30个可分类操作单元（operational taxonomic units, OUTs）。其中属于Y-变形菌纲的细菌有20个,占整个细菌群落的66.7%,其余10种分别属于肠杆菌目（Enterobacteriales）的摩根（氏）菌属（Morganella）、克吕沃氏菌属（Kluyvera）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、拉乌尔菌属（Raoultella）、肠杆菌属（Enterobacter）和肠杆菌科的未知属,黄色单胞菌目（Xanthomonadales）的嗜麦芽窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）和未分类的γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）的细菌。以上属于肠杆菌科的细菌有17种,是雌性生殖系统的优势菌群。属于芽孢杆菌纲（Bacilli）的细菌有5种,占整个雌性生殖系统的16.7%,分属芽孢杆菌目（Bacillales）的芽胞杆菌属（Bacillus）,乳杆菌目（Lactobacillales）的乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）和未分类的链球菌科（Streptococcaceae）。属于β-变形菌纲（Betaproteobacteria）的细菌有3种,占整个雌性生殖系统的1.0%,分属伯克氏菌科（Burkholderiaceae）的伯克氏菌属（Burkholderia）产碱菌科（Alcaligenaceae）无色杆菌属（Achromobacter）。属于α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）,属于根瘤菌目（Rhizobiales）布鲁氏菌科（Brucellaceae）苍白杆菌属（Ochrobactrum）的细菌有1种,占整个细菌群落的0.6%,是雌性生殖系统的较少种类的菌群。属于放线菌纲（Actinobacteria）放线菌目（Actinomycetales）纤维单胞菌科（Cellulomonadaceae）纤维单胞菌属（Cellulomonas）的细菌有1种,占整个雌性生殖系统的0.6%,是雌性生殖系统的较少种类的菌群。2在橘小实蝇的雄性生殖系统中我们分离得到19个OUTs,分属β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）4个不同的细菌纲。在所有分离到的细菌中,属于γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）的细菌有11个,占整个雄性生殖系统的57.89%,是雄性生殖系统的优势菌纲,分属肠杆菌目（Enterobacteriales）的摩根（氏）菌属（Morganella）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）和肠杆菌科的未知属,假单胞菌目（Pseudomonadales）的不动细菌属（Acinetobacter）,未分类的Y-变形菌纲（Gammaproteobacteria）的细菌。属于芽孢杆菌纲（Bacilli）的细菌有5个,占整个雄性生殖系统的26.32%,分属芽孢杆菌目（Bacillales）的芽胞杆菌属（Bacillus）,乳杆菌目（Lactobacillales）的乳球菌属（Lactococcus）、漫游球菌属（Vagococcus）、肠球菌属（Enterococcus）和未分类的链球菌科（Streptococcaceae）。属于β-变形菌纲（Betaproteobacteria）的细菌有2种,占整个雄性生殖系统的10.53%,分属伯克氏菌科（Burkholderiaceae）的青枯菌属（Ralstonia）和未分类的产碱菌科（Alcaligenaceae）。属于α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）的细菌有1种,占整个雄性生殖系统的5.26%,是雄性生殖系统的最少种类的菌群,属于根瘤菌目（Rhizobiales）布鲁氏菌科（Brucellaceae）苍白杆菌属（Ochrobactrum）。3在橘小实蝇的雌性生殖系统中分离得到10种可培养菌群,分别是植生拉乌尔菌（Raoultella planticola）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、日沟维肠杆菌（Enterobacter gergoviae）、河生肠杆菌（Enterobacter amnigenus）、解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、肺炎克雷伯菌肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae）、土生拉乌尔菌（Raoultella terrigena）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）。以上细菌发酵液的室内和野外引诱实验结果表明,上生拉乌尔菌（R. terrigena）、产酸克雷伯菌（K. oxytoca）和植生拉乌尔菌（R. planticola）对橘小实蝇具有较强的引诱效果,且引诱活性为上生拉乌尔菌（R. terrigena）>产酸克雷伯菌（K. oxytoca）>植生拉乌尔菌（R. planticola）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 昆虫体内微生物的研究进展
• 1.1.1 昆虫体内微生物的种类
• 1.1.2 昆虫体内微生物的分布
• 1.1.3 昆虫体内微生物对宿主的生理功能
• 1.2 橘小实蝇及其体内微生物的研究进展
• 1.3 昆虫体内微生物的研究方法
• 1.3.1 传统的培养鉴定方法
• 1.3.2 分子生物学方法（PCR-DGGE分析方法）
• 1.4 本研究的目的与意义
• 1.5 特色与创新之处
• 1.6 本研究的技术路线
• 第二章 橘小实蝇雌性生殖系统细菌分子多态性
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 橘小实蝇的采集和饲养
• 2.1.2 常用培养基及试剂的配制
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 橘小实蝇雌成虫生殖系统的解剖
• 2.2.2 雌性生殖系统细菌的分子鉴定
• 2.2.3 数据统计分析与系统发育树的构建
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 橘小实蝇雌性生殖系统的解剖
• 2.3.2 雌性生殖系统细菌PCR-DGGE分析
• 2.3.4 橘小实蝇雌性生殖系统细菌的系统发育分析
• 2.4 讨论
• 第三章 橘小实蝇雄性生殖系统细菌分子多态性
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 橘小实蝇雄成虫生殖系统的解剖
• 3.2.2 雄性生殖系统细菌的分子鉴定
• 3.2.3 数据统计分析与系统发育树的构建
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 橘小实蝇雄性生殖系统的解剖
• 3.3.2 雄性生殖系统细菌PCR-DGGE分析
• 3.3.3 橘小实蝇雄性生殖系统细菌的系统发育分析
• 3.3.4 橘小实蝇雌雄生殖系统分子多态性的比较
• 3.4 讨论
• 第四章 橘小实蝇雌性生殖系统可培养菌及引诱性研究
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 橘小实蝇雌成虫生殖系统的解剖
• 4.2.2 雌性生殖系统可培养菌的分子鉴定
• 4.2.3 数据统计分析与系统发育树的构建
• 4.2.4 雌性生殖系统可培养菌的生理生化鉴定
• 4.2.5 室内引诱实验
• 4.2.6 野外引诱实验
• 4.2.7 数据统计与分析
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 橘小实蝇雌性生殖系统的解剖
• 4.3.2 雌性生殖系统可培养细菌PCR-DGGE分析
• 4.3.3 橘小实蝇雌性生殖系统可培养菌的系统发育分析
• 4.3.4 橘小实蝇雌性生殖系统可培养菌生理生化鉴定结果分析
• 4.3.5 雌性生殖系统分子多态性与可培养细菌的比较
• 4.3.6 可培养菌发酵液对寄主的引诱活性
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢