论文摘要
[背景]脑卒中防治研究一直是医学界关注的重点。每年全球发生脑卒中9,000,000例,即使存活,1/3患者也会残留中到重度残疾,是我国致死致残的第一大原因。多年来,虽然脑卒中相关的基础研究不断涌现出令人欣喜的新的药物和疗法,但一经进入临床实际,却往往无法获得基础研究中的良好结果,或出现严重并发症如出血（tPA的临床应用副反应）,或无法提供有效的治疗。临床转化遇到瓶颈的一个重要原因是临床患者的实际情况与基础研究对象存在很大差异：临床脑卒中患者一般都具有代谢或心脑血管基础疾病,如高龄、肥胖、高血糖、高血脂、高血压、动脉粥样硬化等,而基础研究的对象却多为年轻健康动物[1],研究对象的病理生理背景差异很有可能是导致临床转化出现问题的主要原因之一。在脑卒中的众多危险因素中,以肥胖为表现的代谢综合征发病率最高,中国肥胖病患者超过七千万,约占全球肥胖人口的20%,且长势迅猛；另一种代谢疾病——糖尿病,在我国发病率也高达9.7%,意味着患病总人数超过1亿。另外,许多流行病学调查显示高血脂、糖尿病等代谢性疾病均是心血管疾病的危险因素,代谢相关疾病不仅增加了脑卒中的患病风险[2],还能导致神经功能预后恶化[3;4]。但临床研究多为相关性分析,缺乏直接的因果证据。Glagov等1987年提出了血管重塑（vascular remodeling）的概念,意指血管损伤的情况下管腔狭窄而无法提供有效生理血流量的改变[5]。早期研究主要集中于冠心病（心脏血管）及高血压（全身动脉）,而近来开始有学者指出代谢相关疾病也可导致脑血管的重塑[6;7],内皮素1（ET1）、基质金属蛋白酶1（MMP-1）等在其中起一定作用。但代谢疾病引起脑血管结构改变或脑缺血损伤变化的相关报道数量有限,证据仍比较薄弱,缺乏明确的因果效应。本研究旨在探索单纯高脂饮食对小鼠代谢指标的影响和脑血管结构、脑缺血再灌注损伤变化,以及MMPs活性在这些变化中的作用,并探讨2型糖尿病小鼠脑血管结构、脑缺血损伤的变化。在探索代谢疾病对脑血管及缺血性损伤影响的同时,我们还探索了小分子药物（TSC,trans-sodium crocetinate）对高脂饮食小鼠脑缺血再灌注损伤的治疗作用和吡格列酮降糖治疗对糖尿病小鼠脑血管病理改变和脑缺血再灌注损伤的抑制作用。TSC是一种跨钠盐化合物,能够通过改变血液中水分子间氢键的结构从而促进小分子（如氧、葡萄糖）的弥散,已证实TSC在健康大鼠及兔的脑缺血损伤中具有神经保护效应。鉴于其作用机理不涉及影响高脂饮食的病理生理改变,我们推测它能够引起高脂饮食动物的脑保护效应。另外,我们还探索了早期少次大剂量吡格列酮注射对糖尿病db/db小鼠的降糖效应,并研究了在血糖控制条件下,糖尿病动物的脑血管重塑和脑缺血损伤变化是否可被逆转。拟为代谢失调患者的脑保护策略提供坚实的理论基础和科学依据。第一部分高脂饮食对小鼠脑血管重塑及脑缺血损伤的影响及MMP-9在其中的作用实验一高脂饮食对CD1小鼠脑血管重塑及脑缺血损伤的影响[目的]观察高脂饮食对CD1小鼠体重、血糖、血脂及脑血管重塑的影响,比较高脂饮食小鼠脑缺血再灌注损伤与正常饮食小鼠的差别。[方法]6周龄CD1小鼠给予正常（n=9）或高脂饮食（n=9）10周后测量体重、血糖与糖化血红蛋白（HbAlc）,后行血管铸模,观察脑表面血管的脑中动脉MCA与大脑前动脉（ACA）、大脑后动脉（PCA）间交通支数、MCA分支曲度变化及MCA起始部内径；另两组动物（n=8每组）灌注后制备石蜡切片行vWF因子免疫荧光染色,观察脑皮层微血管密度及MCA起始部血管壁厚度。另两组动物行90min脑中动脉阻闭再灌注,观察再灌注3d运动协调功能（Rota-rod）,脑水肿、出血性转化率以及脑梗死容积,同批动物处死前取血测量血脂,对应脑水肿程度及脑梗死容积行相关性分析。[结果]高脂饮食可致CD1小鼠肥胖、高脂血症、高血糖；脑表面血管MCA交通支数不变但分支血管曲度增加,MCA起始部内径狭窄、血管壁增厚,脑皮层血管密度增加；高脂饮食还可致小鼠脑缺血再灌注损伤加重,表现为脑水肿程度加重、出血性转化率增高、脑梗死容积增大、运动协调功能下降（P<0.05vs. RD组）。且脑水肿与脑梗死容积均与血浆低密度脂蛋白（LDL）含量、LDL/总胆固醇（Cholesterol）比率,以及LDL／高密度脂蛋白（HDL）比率显著相关。[结论]高脂饮食可致CD1小鼠体重、血糖及高脂增高,并引起脑血管重塑以及脑缺血损伤的加重,而脑缺血损伤程度与血浆LDL关系密切。实验二MMP-9在高脂饮食对小鼠脑血管重塑及脑缺血损伤影响中的作用[目的]探索高脂饮食致小鼠脑血管重塑及脑缺血再灌注损伤加重的机制。[方法]6周龄CD1动物正常饮食（RD）或高脂饮食（HFD）饲养10周后行假手术（Sham）或脑中动脉阻闭再灌注（Con）手术（n=6-11）。再灌注或假手术后6h灌注取材,分为前皮层（Frl,缺血半影区）,其余皮层及纹状体（缺血核心区）三部分。Western blot测量全细胞MMP-9,claudin-5,occludin含量。凝胶酶谱法测量胞浆MMP-2及MMP-9的活性。采用MMP-9基因敲除的背景鼠C57BL/6J或MMP-9-／-动物重复正常或高脂饮食喂养,观察体重、血脂、血糖、HbAlc的变化,观察高脂饮食对脑血管重塑的影响、免疫组化方法观察再灌注24h IgG渗出（C57BL/6J）,再灌注72h（C57BL/6J）或24h（或MMP-9-/-）出血性转化,脑水肿、脑梗死容积及运动协调功能变化。[结果]高脂饮食可诱导CD1小鼠缺血区与非缺血区脑MMP-9活性增加,但并不影响脑内Claudin5和occludin的表达。高脂饮食动物体重明显增加,并伴随血糖升高,血脂各项检查指标也较正常饮食动物增高。C57BL/6J小鼠高脂饮食后可导致脑中动脉分支血管曲度增加,且MCA起始处内径缩小,此外,高脂饮食还可导致C57BL/6J小鼠脑梗死容积增大,水肿增加,IgG渗出增多,出血性转化率增高以及运动协调功能减弱。尽管高脂饮食会引起MMP-9-／-小鼠体重、血糖与血脂的增高,但却并没有观察到高脂饮食可引起脑血管重塑或加重脑缺血损伤。[结论]高脂饮食可诱导正常动物脑血管重塑,并加重局灶性脑缺血损伤后的神经功能预后,而MMP-9的活化在这两个过程中都起到重要作用。第二部分TSC对高脂饮食致代谢综合征小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[目的]探索TSC （Trans-sodium crocetinate）对高脂饮食致代谢综合征小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。[方法]6周龄CD1动物高脂饮食（HFD）饲养10周后行脑中动脉阻闭90mmin再灌注手术（n=6-11）。TSC治疗分为两剂治疗组（0.14mg/kg,0.28mg/kg及0.70mg/kg三个不同剂量,每只动物药物总量分为两剂分别于缺血10min与再灌注10min经尾静脉注入）；与推注—泵注—推注治疗组（0.14mg/kg,每只动物总剂量平均分为8份,缺血10min推注1/8,后将6/8剂量匀速泵注60min,结束后,相当于再灌注前20min,将最后1/8体积药量一次性推注）。每种治疗方法均有特异的生理盐水对照,在给药时间给予同等容量的生理盐水。治疗结束后72h进行运动协调神经功能评估,取脑判断出血性转化率,测量脑水肿指数与梗死容积百分比。治疗有效组及其响应对照组另取两组动物于再灌注24h取脑组织,测量硝基酪氨酸,4-羟基-2-壬烯醛含量反映氧化应激水平,明胶酶谱法测量MMP-2、MMP-9活性,western blot检测MMP-9表达,以及炎性因子TNF-a及ICAM-1含量,并利用免疫荧光方法观察了MMP-9在缺血后脑皮层表达的细胞定位。[结果]TSC两剂治疗组中的三种剂量均未改善神经损伤。而TSC推注—泵注—推注治疗（0.14mg/kg）明显降低出血性转化发生率,减轻脑水肿以及缩小脑梗死容积,运动协调功能也显著提高。此外TSC还明显减少了再灌注24h高脂饮食动物缺血测脑组织的硝基酪氨酸蛋白含量,MMP-9活性及表达,以及炎症因子的表达。[结论]推注—泵注—推注TSC （0.14mg/kg）治疗方法能明显改善高脂饮食小鼠脑缺血再灌注损伤后的神经功能预后。这一保护效应可能与改善缺血组织氧供并减轻氧化应激、抑制MMP-9活性及炎症因子表达有关。第三部分糖尿病对小鼠脑血管重塑及脑缺血损伤的影响及早期吡格列酮降糖治疗的脑保护作用研究[目的]观察不同年龄糖尿病db/db小鼠较背景动物C57BLKS小鼠脑血管是否发生重塑,脑缺血损伤是否加重及吡格列酮早期降糖治疗对该变化的影响。[方法]9或15周龄db/db小鼠或其背景动物C57BLKS小鼠（db+）测量体重、血糖与HbAlc后行血管铸模（n=7-10）,观察脑中动脉（MCA）与大脑前动脉（ACA）、大脑后动脉（PCA）之间的交通支数目、MCA分支血管曲度变化及MCA起始部内径；另外两组5周龄左右db/db小鼠,血糖升高早期起行吡格列酮降糖治疗（Actos,100mg/kg隔日注射,三次）或药物佐剂DMSO对9周龄动物脑血管重塑的影响；另外四组动物（db+,db++A, db/db,db/db+A）利用脑中动脉阻闭45min再灌注模型观察糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤较基因背景鼠的变化,评估运动协调功能（Rota-rod）、出血性转化率、脑水肿及脑梗死容积,并采用吡格列酮降糖治疗观察其对糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤的影响。[结果]糖尿病可致9周龄小鼠肥胖、高血糖；脑表面血管MCA与ACA或PCA交通支数不变但MCA分支血管曲度增加,MCA起始部管径变窄；糖尿病时间延长（15周龄）没有进一步加重脑血管重塑的程度（MCA与ACA或PCA交通支数没有增加）,而吡格列酮降糖治疗可降低db/db小鼠血糖和HbAlc,但对血脂及体重没有明显影响,吡格列酮抑制了9周龄动物脑血管曲度和MCA起始部管径的改变；糖尿病动物脑缺血再灌注损伤加重,表现为运动协调功能下降,出血性转化率增加,脑水肿及梗死容积增大,而吡格列酮降糖治疗可抑制这一改变。[结论]糖尿病可致小鼠脑血管重塑及脑缺血再灌注损伤加重,而吡格列酮降糖治疗可抑制这些变化。
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