消瘀化痰饮对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织UCP2表达的影响

论文摘要

目的:消瘀化痰饮（由丹参、郁金、泽泻、制半夏、柴胡、决明子、生黄芪、炒白术等药物组成）具有消瘀化痰、疏肝健脾功效,为导师经临床观察筛选的效方,对非酒精性脂肪肝（NAFLD）具有较好的治疗效果,为了进一步探讨其作用机理,参照相关文献运用高脂饮食复制NAFLD大鼠模型,同时施加药物干预,观察了其对NAFLD大鼠脂质代谢、肝功能的影响,探讨了其促进脂质代谢、保护肝功能的作用机制;运用免疫组化和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法观察了其对实验大鼠肝组织解偶联蛋白2（UCP2）表达的影响,探讨了其抑制UCP2过度表达的作用机制;并运用光镜和电镜观察了本方对肝组织形态学的影响。方法第一部分消瘀化痰饮对NAFLD大鼠脂质代谢和肝组织形态学的影响选用SD大鼠50只,体重160～180g,雄性。大鼠自由饮水进食,饲养于18℃～22℃明暗各24小时的清洁级动物实验室内。正常喂养1周后,随机分为5组:正常对照组（简称正常组,normal control group,N）、模型对照组（简称模型组,model group,M）、消瘀化痰饮高剂量组（简称高剂量组,high-dose Xiao-Yu-Hua-Tan-Yin group,H）、消瘀化痰饮低剂量组（简称低剂量组,low-dose Xiao-Yu-Hua-Tan-Yingroup,L）、阳性药（东宝甘泰）对照组（简称对照组,Dong-Bao-Gan-Tai control group,D）。除正常组喂饲普通饲料外,其余各组均喂饲高脂饲料。同时各用药组灌服治疗药或对照药,正常组与模型组灌服等量生理盐水,每天上午灌胃1次,每次用药体积均按1ml/100g计算,持续灌胃8周。9周末,于最后1次给药后禁食12h麻醉状态下股动脉取血,将血样低温离心,分离血清,密封,-20℃冷贮备用。于肝脏最大叶距边缘0.5cm处取0.1×0.1×0.1cm3肝组织浸泡于4%戊二醛中固定,以备电镜观察。另取少许肝组织液氮冷冻以备检测肝匀浆TG、TC ,然后取相同部位肝组织0.5×0.5×0.5cm3置于4%多聚甲醛液中固定,HE染色,以备光镜观察。第二部分消瘀化痰饮对NAFLD大鼠肝组织UCP2表达的影响实验动物分组、用药情况同前。连续喂养9周,确定脂肪肝形成后,于最后1次给药禁食12h后麻醉动物,剖取肝脏,在肝脏最大叶距边缘0.5cm处取适量肝组织置于液氮中冷冻,以备运用RT-PCR法观察肝组织UCP2mRNA的表达变化;再取相同部位0.5cm×0.5cm×0.5cm3大小的肝组织于4%多聚甲醛中固定,以备运用免疫组化法观察肝组织UCP2的表达变化;另取相同部位适量肝组织,制作肝组织匀浆测定ATP的含量。结果第一部分消瘀化痰饮对NAFLD大鼠脂质代谢和肝组织形态学的影响1消瘀化痰饮对NAFLD大鼠血清TG、TC、FFA含量的影响模型组大鼠血清TG、TC、FFA的含量（1.17±0.096、3.27±0.18、480.475±18.94）明显高于正常组（0.56±0.084、1.45±0.20、225.71±15.98）（P<0.01）。经用药干预,各用药组均能显著降低模型大鼠血清TC、TG、FFA含量,与模型组比较均具有显著性差异（P<0.01）。其中高剂量组大鼠血清TG、TC、FFA含量（0.52±0.065、1.44±0.11、221.43±15.32）和低剂量组（0.57±0.32、1.56±0.63、241.42±16.96）较对照组（0.76±0.07、2.06±0.28、331.90±16.32）均明显降低（P<0.01）,而高、低剂量组之间经统计学处理无明显差异（P>0.05）。2消瘀化痰饮对NAFLD大鼠AST、ALT活性的影响模型组大鼠血清AST、ALT的活性（32.37±2.45、15.84±1.01）明显高于正常组（26.59±2.33、10.89±0.86）（P<0.01）。经用药干预,各用药组大鼠血清AST、ALT的活性均有明显的下降,与模型组比较,差异有显著性（P<0.01）。其中低剂量组AST的活性（19.45±1.90）较对照组（23.19±1.78）低（P<0.05）,高剂量组ALT活性（4.16±0.89）高于对照组（7.32±0.45）（P<0.05）;而高、低剂量组之间AST、ALT的活性经统计学处理无明显差异（P>0.05）。3消瘀化痰饮对NAFLD大鼠肝脏TG、TC的影响模型组大鼠肝脏TG、TC的含量（0.82±0.08、0.44±0.07）明显高于正常组（0.45±0.05、0.27±0.04）（P<0.01）。经用药干预,各用药组均能显著降低模型大鼠肝组织TG、TC的含量（P<0.01）。其中高剂量组TC的含量（0.27±0.04）低于对照组（0.34±0.05）（P<0.05）,而高、低剂量组TC的含量经统计学处理无明显差异（P>0.05）;各用药组TG的含量经统计学处理无明显差异（P>0.05）。4肝组织形态学改变光镜可见:正常组大鼠肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,中央静脉大而壁薄,肝细胞排列成肝索,在中央静脉周围呈放射状分布,细胞呈多边形。模型组大鼠肝细胞中度细胞水肿,少量的肝细胞坏死,多数肝细胞内可见大小不等、数量不一的脂滴空泡（脂肪变性）,重度变性者,脂滴空泡融合,呈现中至重度脂肪变性,但未见明显的纤维化改变。各用药组动物肝小叶和肝血窦结构清晰,高、低剂量组肝细胞内脂滴空泡基本消失,对照组中少量的肝细胞内仍有脂滴空泡,并有轻度的细胞水肿。透射电镜可见:正常组大鼠肝脏细胞质中线粒体、粗面内质网等基本正常;模型组细胞质内充满了大、小不同的脂滴,线粒体全部脊融合、消失;粗面内质网有轻度脱颗粒现象。对照组细胞胞浆内可见大、小不等脂滴,线粒体肿胀、内质网有部分断裂现象。高、低剂量组上述情况明显改善,肝细胞胞浆有少量脂滴,线粒体形态基本正常,脊数目明显增多,仅部分可见轻度肿胀变形,内质网基本正常。第二部分消瘀化痰饮对NAFLD大鼠肝组织UCP2表达的影响1各组大鼠肝组织ATP含量的变化模型组大鼠肝组织ATP的含量（2.78±0.16）明显低于正常组（4.66±0.12）（P<0.01）。经用药干预后,各用药组大鼠ATP的含量均高于模型组（P<0.01）。其中,高、低剂量组大鼠肝组织ATP的含量（4.57±0.13、4.39±0.19）明显高于对照组（4.24±0.16）（P<0.01）;高剂量组大鼠肝组织ATP的含量高于低剂量组（P<0.01）。2各组大鼠肝组织UCP2表达的变化半定量分析显示:模型组大鼠肝组织UCP2表达的平均灰度（0.0883±0.0079）明显低于正常组（0.2170±0.0106）（P<0.01）。经用药干预后,各用药组大鼠肝组织的平均灰度均高于模型组（P<0.01）。其中,高、低剂量组平均灰度（0.1627±0.0130、0.1310±0.0046）高于对照组（0.1103±0.0064）（P<0.01）;高剂量组平均灰度高于低剂量组（P<0.01）。3各组大鼠肝组织UCP2mRNA表达的变化RT-PCR后,琼脂糖凝胶电泳,在479bp、587bp处分别显示出UCP2mRNA和β-actin电泳带,与预期结果一致。模型组大鼠肝组织UCP2mRNA的表达（0.4065±0.0281）显著高于正常组（0.0944±0.0102）（P<0.01）。给药后,各用药组UCP2mRNA的表达显著低于模型组（P<0.01）,其中,高、低剂量组UCP2mRNA的表达（0.1846±0.01301、0.1790±0.0134）低于对照组的表达（0.2669±0.0208）（P<0.01）,而高、低剂量组之间无显著性差异（P>0.05）。结论1消瘀化痰饮能显著降低NAFLD大鼠血清和肝组织内异常升高的TC、TG、FFA的含量,抑制血清内ALT和AST活性的异常升高,呈现出良好的调脂护肝作用。2消瘀化痰饮可明显改善NAFLD大鼠肝组织的病变程度,表现为用药后大鼠肝小叶和肝血窦结构清晰,肝细胞内脂滴空泡基本消失;线粒体形态基本正常,脊数目明显增多。3消瘀化痰饮能抑制NAFLD大鼠肝组织UCP2的过度表达,增加ATP的合成和线粒体的能量贮备,促进脂肪酸代谢,以达到治疗NAFLD的目的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 消瘀化痰饮对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织UCP2 表达的影响
• 引言
• 第一部分 消瘀化痰饮对非酒精性脂肪肝大鼠脂质代谢和肝组织形态学的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 消瘀化痰饮对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织UCP2 表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述 中医药治疗非酒精性脂肪肝的研究进展
• 致谢
• 个人简历