人红细胞单链抗体的制备与血凝试验方法的初步建立

论文摘要

自身红细胞凝集试验（Autologous red cell agglutination assay,AGEN）是一种简便、特异又不需要任何特殊仪器的快速诊断方法。其灵敏性和特异性不亚于ELISA,且可同时检测IgG和IgM,具有安全、快速、准确、价廉的特点,检测时无需分离血清,无需仪器设备,仅需一滴全血,在2 min内可得到检测结果,非常适合条件简陋的基层医院、义务献血前以及紧急输血前的使用,因而具有良好的应用前景。该方法依赖于一种双功能试剂,该试剂具有结合人红细胞和病人血液中的抗原或抗体的特性。当病人血液中有针对双功能试剂的抗原或抗体存在时,由于与双功能试剂的分子间交联而导致红细胞的凝集。因此本研究的目的是制备人红细胞非凝集型单克隆抗体,进而形成双功能抗体试剂,用于临床诊断。本研究用三种免疫原免疫BALB/c小鼠来制备人红细胞非凝集型单克隆抗体,通过化学偶联法制备出双功能抗体,进而形成全血凝集检测试剂,并对血凝试验方法进行了初步探讨。主要研究内容如下:1、分别用人O型红细胞、红细胞全膜和红细胞膜蛋白作为抗原,采用腹腔加尾部静脉注射免疫BALB/c小鼠,取免疫脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,细胞比例为5∶1,经间接ELISA、红细胞直接凝集试验和间接凝集试验检测,采用有限稀释法进行克隆,经过3次克隆后获得1株人红细胞非凝集型单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为1C3。经过多次传代、冻存、复苏,杂交瘤细胞分泌抗体能力仍然稳定,其抗体亚类类型为IgG1。常规方法诱生腹水,辛酸-硫酸铵沉淀法和DEAE纤维素层析法对腹水进行纯化。腹水单抗ELISA效价在1:104～1:105之间,并与其它种属无交叉反应,亲和力高。2、分别用胃蛋白酶消化人红细胞非凝集型单克隆抗体和乙肝表面抗体,经纯化得到人红细胞单抗和乙肝表面抗体的F（ab’）2片段。通过戊二醛一步法和戊二醛两步法将非凝集型单抗和乙肝表面抗体的F（ab’）2片段进行偶联来制备双功能抗体。经SDS-PAGE电泳鉴定,通过戊二醛一步法成功制备了双功能抗体,进而形成双功能检测试剂,对该试剂的活性进行了初步的鉴定,同时初步建立了一种检测血液中乙肝表面抗原的方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号表
• 第一章 引言
• 1.1 抗体的研究进展
• 1.1.1 多克隆抗体
• 1.1.2 单克隆抗体
• 1.1.3 基因工程抗体
• 1.2 单链抗体的研究进展
• 1.2.1 单链抗体的结构特点
• 1.2.2 单链抗体的构建
• 1.2.3 单链抗体的载体
• 1.2.4 单链抗体的表达
• 1.2.5 单链抗体应用前景与展望
• 1.3 人红细胞单抗的国内外研究进展
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.5 本研究技术路线
• 第二章 人红细胞非凝集型单克隆抗体的制备及初步应用
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物和细胞
• 2.1.2 主要试剂和材料
• 2.1.3 主要溶液及其配制
• 2.1.4 主要培养基及其配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗原的制备
• 2.2.2 小鼠免疫
• 2.2.3 间接ELISA法的建立
• 2.2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
• 2.2.5 饲养细胞的制备
• 2.2.6 免疫脾细胞的制备
• 2.2.7 细胞融合
• 2.2.8 杂交瘤细胞的早期培养
• 2.2.9 杂交瘤细胞阳性孔的检测
• 2.2.10 杂交瘤细胞株的筛选
• 2.2.11 杂交瘤细胞株的冻存和复苏
• 2.2.12 杂交瘤细胞株的传代稳定性
• 2.2.13 杂交瘤细胞株的染色体鉴定
• 2.2.14 单抗的制备和效价检测
• 2.2.15 单抗的纯化
• 2.2.16 单抗纯度的鉴定
• 2.2.17 单抗亚型的测定
• 2.2.18 单抗特异性的鉴定
• 2.2.19 单抗相对亲和力的测定
• '）₂片段制备'>2.2.20 抗体F（ab^'）₂片段制备
• '）₂片段的纯化'>2.2.21 抗体F（ab^'）₂片段的纯化
• '）₂片段的纯度鉴定'>2.2.22 抗体F（ab^'）₂片段的纯度鉴定
• 2.2.23 双功能抗体的制备
• 2.2.24 双功能抗体的纯化及鉴定
• 2.2.25 全血凝集检测试剂的形成
• 2.2.26 全血凝集检测试剂的鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 红细胞膜蛋白抗原浓度的测定
• 3.2 完整红细胞抗原最佳免疫量的确定
• 3.3 最佳酶标二抗工作浓度的确定
• 3.4 阳性对照工作浓度的确定
• 3.5 最佳抗原包被量的确定
• 3.6 免疫效果检测
• 3.7 阳性杂交瘤细胞株的检测和筛选
• 3.8 单抗的冻存和传代稳定性测定
• 3.9 杂交瘤细胞株染色体鉴定
• 3.10 单抗腹水制备
• 3.11 单抗腹水效价测定
• 3.12 单抗蛋白浓度的测定
• 3.13 单抗腹水纯度测定
• 3.14 单抗亚型的测定
• 3.15 单抗的特异性鉴定
• 3.16 单抗相对亲和力的测定
• ′）₂片段的得率'>3.17 胃蛋白酶消化单抗效果的鉴定和F（ab^′）₂片段的得率
• ′）₂片段的纯化和双功能抗体偶联的鉴定'>3.18 F（ab^′）₂片段的纯化和双功能抗体偶联的鉴定
• 3.19 全血凝集检测试剂的鉴定
• 第四章 讨论
• 4.1 免疫原的制备与选择
• 4.2 小鼠免疫
• 4.3 红细胞抗体检测方法
• 4.3.1 间接ELISA检测
• 4.3.2 固相微板法
• 4.4 单克隆抗体制备的影响因素
• 4.4.1 SP2/0骨髓瘤细胞
• 4.4.2 细胞融合
• 4.4.3 杂交瘤细胞的筛选
• ′）₂片段酶切与片段纯化'>4.5 F（ab^′）₂片段酶切与片段纯化
• 4.6 双功能抗体的制备
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历及在学习期间发表的学位论文