红藻附生琼胶降解细菌的分离鉴定及HQM9琼胶酶研究

论文摘要

对红藻门江蓠和石花菜附生的琼胶降解细菌进行了系统的分离,共筛选得到琼胶降解细菌25株,选择其中有代表性的15株进行了分子鉴定,其中13株可以鉴定到属。鉴定结果表明这些细菌主要分布在Agarivorans, Cellulophaga, Alteromonas, Saccharophagus, Glaciecola, Vibrio六个属中,另外,基于16Sr DNA序列分析和系统发育分析,初步推断WH0801为噬琼胶菌属（Agarivorans）的一个新种；JL1为交替单胞菌科（Alteromonadales）一个新属新种；HQM9为黄杆菌科（Flavobacteriaceae）的一个新种。对海洋细菌WH0801进行了菌种鉴定：根据16S rDNA序列分析,细菌WH0801和Agarivorans albus MKT 106T序列同源性为96.1%,可以初步确定细菌WH0801属于噬琼胶菌属（Agarivorans）。经过形态学、生理生化特性、脂肪酸分析、DNA杂交结果和产酶差别综合分析,细菌WH0801与目前已发表的噬琼胶菌属唯一种——白色噬琼胶菌不同,而是噬琼胶菌属（Agarivorans）的一个新种,根据其特征将其命名为淡黄色噬琼胶菌（Agarivorans gilvus）,其模式菌株为WH0801T （=CGMCC 1.10131T=NRRL B-59247T）。在研究中分离到一株具琼胶降解能力、产黄色素的细菌,暂命名为HQM9。16S rDNA的测序结果表明该菌属于黄杆菌科（Flavobacteriaceae）,与该科中明确鉴定到种的Aquimarina intermedia LMG 23204T有最大的相似度,仅为95.19%,同时与该科中其他成员系统发育关系显示,HQM9与黄杆菌科中的成员进化距离都较远,可以初步推断细菌HQM9为黄杆菌科的一个新的成员。对细菌HQM9的产酶条件、粗酶液性质进行初步研究。结果显示,最佳产酶条件为初始pH 7.5,发酵温度28℃,2.5%的NaCl浓度,碳源和氮源分别为琼脂和蛋白胨,琼脂对琼胶酶的产生有明显的诱导作用,但琼胶酶的产生不完全受底物——琼脂的诱导；粗酶液的最适酶促反应条件：温度40-45℃,pH为7.0,底物浓度为1.2%,多种金属离子抑制酶活。利用活性电泳对粗酶液中的琼胶酶的酶谱分析结果显示,HQM9的发酵液中至少分泌八种琼胶酶组分。完成了细菌HQM9全基因组测序,根据BLAST结果推断,该菌具有28个可能的琼胶酶基因,其中13个属于GH16家族,其余的15个分类地位暂不明确。对其中两个GH16家族的基因aga16G和aga16Y进行了生物信息学分析,结果表明与aga16G具有最大同源性的蛋白质序列相似度仅为47%；aga16Y与已知琼胶酶的相似度较高,为87%。根据aga16G和aga16Y的基因序列设计引物（包括酶切位点和启动子）,扩增目的片段,然后将基因亚克隆到原核表达载体pET24a,构建表达载体pET24a- agal6Glagal6Y,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后检测到菌体内有大量蛋白表达,且发酵上清液中能够检测到琼胶酶活性,证明基因aga16G和aga16Y都为琼胶酶基因,综合其序列相似性分析,可以初步确定基因aga16G和aga16Y都为新的琼胶酶基因,表达后的重组琼胶酶命名rAga16G和rAga16Y。对rAga16Y进行了进一步的研究表明表达产物主要是以包涵体的形式存在于菌体内。利用High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱纯化重组蛋白,透析复性后检测酶活,Native-PAGE进行酶谱分析,获得纯化的重组琼胶酶rAga16Y,对其酶学性质进行初步研究。结果表明rAga16Y最适的酶促反应条件为：底物（琼脂糖）浓度1.5%、温度55℃、pH 8.0。另外,K+对酶促反应有促进作用,多种金属离子（Zn2+、Mn2+、Cu2+、Pb2+、Co2+）会不同程度的抑制酶促反应的进行。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 琼胶
• 1.2 琼胶酶的研究进展
• 1.3 琼胶酶的应用
• 1.4 论文的立题依据和研究内容
• 第二章 红藻附生琼胶降解细菌的分离及鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 培养基及主要试剂
• 2.1.2 样品采集与处理
• 2.1.3 菌株的筛选
• 2.1.4 细菌16S rDNA序列测定与系统发育分析
• 2.2 结果及其分析
• 2.2.1 琼胶降解细菌的筛选结果
• 2.2.2 琼胶降解细菌的分子鉴定及系统发育分析
• 2.3 讨论
• 第三章 淡黄色噬琼胶菌WH0801的鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.2 海洋细菌WH0801的鉴定结果
• 3.3 结论
• 第四章 海洋细菌HQM9的发酵条件及酶学性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 细菌HQM9的分子生物学鉴定
• 4.1.2 细菌HQM9的形态观察及生长条件研究
• 4.1.3 粗酶液酶活力的测定
• 4.1.4 细菌HQMg产酶条件的研究
• 4.1.5 细菌HQM9粗酶液琼胶酶性质的初步研究
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 细菌HQM9的生理生化特征
• 4.2.2 细菌HQM9的脂肪酸分析
• 4.2.3 细菌HQM9的16SrDNA序列分析
• 4.2.4 菌株HQM9产酶的发酵条件研究结果
• 4.2.5 粗酶液酶学性质研究
• 4.3 讨论
• 第五章 HQM9的基因组及琼胶酶基因的生物信息学分析
• 5.1 细菌HQM9的基因组的生物信息学分析
• 5.1.1 HQM9基因组测序结果分析
• 5.1.2 琼胶酶基因预测与初步分析
• 5.2 基因aga16G和aga16Y的生物信息学分析
• 5.2.1 基因aga16G的序列分析结果
• 5.2.2 基因aga16Y的序列分析结果
• 5.3 结论
• 第六章 细菌HQM9琼胶酶基因的表达及酶学性质研究
• 6.1 材料与方法
• 6.2 基因aga16G和aga16Y的克降与表达
• 6.3 重组琼胶酶rAga16Y的酶学性质研究
• 6.4 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表