血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶在肾细胞中的定位及其与醛糖还原酶关系的研究

论文摘要

血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶（serum and glucocorticoid inducible proteinkinase,SGK）是一种新发现的丝/苏氨酸蛋白激酶,与其他蛋白激酶主要在酶活性水平上受翻译后的磷酸化和去磷酸化调控显著不同的是,SGK1的转录、活性以及亚细胞定位受到不同胞内和胞外刺激因素的调节,是多种胞内信号途径的功能性交汇点,参与了细胞增殖、渗透调节、离子通道调节以及细胞生存和/或凋亡应答等过程,与糖尿病肾病、高血压等疾病密切相关。然而,SGK1在信号转导通路中的分子机制还不是很清楚,其底物的发现也很有限。尤其SGK1的亚细胞定位研究仍存在很多争议,在细胞内表达外源的SGK1与细胞内源表达的SGK1的亚细胞定位也存在差异。因此,SGK1的亚细胞定位仍是值得深入探讨的问题,研究SGK1的亚细胞定位有利于进一步研究SGK1的底物以及其在各种细胞活动中所担任的角色和作用机制。在本文的研究中,我们通过免疫细胞化学,western blot,以及基因沉默（RNAi）等技术检测了小鼠肾内髓质集合管上皮细胞（mouse inner medullary collecting duct,mIMCD3）中内源表达的SGK1的亚细胞定位情况,同时构建了带有Flag标签的SGK1表达载体sgk1-Flag-pCMV5,通过免疫细胞化学和核浆分离等技术检测了外源SGK1在mIMCD3细胞中的分布情况。结果证明了在mIMCD3细胞中内源表达的SGK1定位于细胞核中,外源表达的SGK1在细胞质和细胞核都有分布,然主要还是分布于细胞核中。并且,我们发现了在mIMCD3细胞中,高盐培养环境可诱导SGK1的高表达。醛糖还原酶（aldose redutase,AR）作为多元醇糖代谢通路中的限速酶,在糖尿病肾病中起着重要作用。近几年来的研究也证实SGK1参与了糖尿病肾病的发生。然而,关于AR与SGK1之间是否存在关系的研究迄今仍未见报道。我们利用AR的化学酶抑制剂（zopolrestat,ARI）和AR siRNA,通过免疫细胞化学,western blot等技术进行AR与SGK1的关系研究,结果发现,在体外培养的mIMCD3细胞中,当细胞内AR的活性被ARI抑制或AR的表达被AR siRNA抑制后,SGK1的表达也受到抑制,说明该细胞内SGK1的表达受到AR的正调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 引言
• 1.2 SGK的发现
• 1.3 SGK1的结构
• 1.4 SGK1的调节机制
• 1.4.1 SGK1的转录调节
• 1.4.2 SGK1的磷酸化调节
• 1.5 SGK1的细胞定位
• 1.6 SGK1的生物学功能
• 1.6.1 SGK1调节离子通道的功能
• 1.6.2 SGK1抑制细胞凋亡的功能
• 1.6.3 SGK1与糖尿病
• 1.7 AR与糖尿病
• 1.8 AR与SGK1的关系
• 1.9 本文研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒构建及纯化实验
• 2.2.2 细胞培养
• 2.2.3 药物处理
• 2.2.4 RNA干扰实验
• 2.2.5 细胞转染
• 2.2.6 核浆分离提取蛋白质
• 2.2.7 蛋白提取与Western blot
• 2.2.8 免疫细胞化学（immunocytochemistry,ICC）
• 3 实验结果
• 3.1 高盐诱导SGK高表达
• 3.2 SGK1的亚细胞定位
• 3.3 外源表达SGK1的亚细胞定位
• 3.3.1 构建获得表达质粒sgk1-Flag-pCMV5
• 3.3.2 外源SGK1的表达及亚细胞定位
• 3.4 AR与SGK1的关系
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢