β-NGF及受体在胰腺癌嗜神经性中的分子机制研究

论文摘要

目的:从胰腺癌手术切除标本、体外细胞培养、动物模型三个层次探讨β-NGF、TrKA、P75NGFR在胰腺癌神经转移中的作用机制,着重研究体外胰腺癌MIA Paca-2细胞趋化、侵袭等生物学特性的变化;离体癌细胞、在体肿瘤组织、神经组织中,β-NGF-NGFR生物轴系统表达的组织细胞特异性,且彼此之间可能的相互协同作用。从而探索β-NGF在神经浸润中所起作用和可能的分子机制,为阐明胰腺癌嗜神经性发病机制提供理论基础、为将来寻找可能的作用靶点提供参考。方法:采用免疫组化法检测胰腺癌组织中β-NGF、TrKA、P75NGFR、E-cadherin、MMP-2各指标的表达、分布特点,并分析与临床病理学特征之间的关系。体外培养未分化人胰腺癌MIA Paca-2细胞,应用扫描和透射电镜观察β-NGF作用后癌细胞表面和内部超微结构的变化。MTT和FCM检测外源性β-NGF、TrKA特异性拮抗剂K252a对MIAPaca-2增殖的影响。酶标仪观察β-NGF对癌细胞黏附能力影响。划痕/过河实验与Transwell侵袭小室观察β-NGF对MIA Paca-2细胞运动、趋化和侵袭能力的影响。Matrigel/癌细胞共培养72h后,Masson染色观察癌细胞周围人工基质被融解情况。建立裸小鼠胰腺癌皮下和原位移植瘤动物模型,用HE和硝酸银染色检测体内神经纤维的侵袭情况。电镜观察受侵袭神经纤维超微结构的破坏情况。RT-PCR、Real time RT-PCR、Western bolt方法检测在裸鼠体内胰腺癌细胞中β-NGF、TrKA、P75NGFRmRNA、蛋白的表达。结果:手术标本:β-NGF、TrkA、P75NGFR、E-cadherin及MMP-2均参与胰腺癌的发生发展。胰腺癌神经浸润几率为56.25%（45/80）。β-NGF、TrkA可能与胰腺癌细胞分化程度、淋巴结转移、神经转移和临床分期密切相关。β-NGF与TrKA、MMF-2表达均呈正相关,与E-cad呈负相关,而与P75NGFR无相关性。体外细胞实验:人胰腺癌细胞系MIA Paca-2为未分化细胞,易于贴壁生长。电镜见培养细胞相互接触后,接触面细小绒毛减少,变为较粗的“残枝样”突起,而位于多个细胞间的细胞随着与其它细胞及培养面实际接触面积的减少,逐渐变圆,最后整个细胞逐渐脱离培养面成为脱落细胞,漂浮于培养液中,凋亡小体少见。予β-NGF后见细胞集落、密度和圆形深染细胞增多,细胞表面绒毛、微绒毛和纤毛变粗、变长,细胞内微丝、微管增多、增大、增粗,较对照组明显。细胞爬片IHC示:MIA Paca-2细胞中β-NGF、TrKA及P75NGFR均有明显表达,以TrKA表达最为明显。MMP-2、E-cadherin也有不等:量表达、分布。MTT和FCM示:β-NGF可促进MIA Paca-2细胞的增殖,主要是增加细胞周期中S期和G2/M期细胞的比例,而减少G0/G1期细胞的比例,各组间有统计学意义（P＜0.05）。高亲和力受体TrKA抑制剂K252a则可抑制β-NGF对细胞的促增殖作用,各组间有统计学意义（P＜0.05）。细胞划痕实验中,对照组过河时间为（68.45±3.53）h,β-NGF组过河实验为（42.50±4.12）h,β-NGF组过河时间明显缩短（P＜0.01）。趋化侵袭实验:随着外源性β-NGF浓度的增加,MIA Paca-2细胞的侵袭和趋化能力均明显增强,组间存在显著性差异（P＜0.05）。而K252a则呈浓度依赖性明显抑制肿瘤细胞的趋化、侵袭能力,呈明显的浓度效应关系。β-NGF可降低癌细胞间的黏附能力,促进运动迁移。成功建立了裸鼠皮下和原位移植瘤胰腺癌动物模型,皮下移植瘤五脏器转移,原位移植瘤在4W、6W和8W时均可见PNI,几率分别为50%、80%和60%,并可见多种脏器转移。6W原位移植瘤组织坏死少见、结构清晰。病理解剖见部分受侵神经组织大量密集分布。IHC、RT-PCR、Real timePCR、Western bolt、基因测序等方法检测结果示,6wks原位移植瘤组织中β-NGF、TrKA和P75NGFR的mRNA、蛋白表达量明显增加,而E-cad mRNA、蛋白表达较对照组织明显降低.原位瘤细胞β-NGF、TrKA、P75NGFR、E-cadherin、MMP-2阳性表达,双染见β-NGF和TrKA可同时表达,瘤细胞TrKA表达较多,神经纤维β-NGF表达较多。瘤细胞超微结构示表面的突起、微绒毛、纤毛明显增多、变粗;细胞内微丝、微管明显变粗、变长。尤以伴PNI之原位瘤细胞为甚。β-NGF和TrKA基因测序结果经NCBI Blast比对,发现β-NGF序列与Genbank中位于1P21—1P22.1的已知序列（AF411526）完全一致、TrKA与M23102完全一致。结论:体内、体外MIA PaCa-2细胞均同时表达β-NGF和TrKA,但以TrKA为主,说明癌细胞在体内、体外生物学功能一致性。神经细胞也可同时表达β-NGF和TrKA,但以β-NGF为主。癌细胞与神经细胞TrkA、β-NGF同时双相交互高表达,β-NGF和TrKA相互作用,通过信号传递,可能既可引起局部癌细胞增殖,也可引起癌细胞迁移运动,最终导致神经浸润。β-NGF可能通过促进MMP-2/9表达、降低黏附分子E-cad表达、对细胞表面及胞内骨架蛋白等超微结构影响等等,在多个环节增强了胰腺癌细胞的体外侵袭能力,在多个步骤、多阶段协同作用共同导致嗜神经性发生。首次提出胰腺癌嗜神经性的“神经生成拟态（Neurotrophin Mimicry,NM）”假说,并分析了其产生原因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、β-NGF、E-cadherin及MMP-2在人胰腺癌组织中的表达分布及与临床病理学特征之间的关系
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、β-NGF对MIA PaCa-2细胞形态学、增殖与趋化性、侵袭性的研究
• 实验一:β-NGF对MIA PaCa-2胰腺癌细胞超微结构的影响
• 2.1.1 对象和方法
• 2.1.2 结果
• 2.1.3 讨论
• 2.1.4 小结
• 实验二:β-NGF对人胰腺癌MIA PaCa-2细胞增殖能力及细胞周期的影响
• 2.2.1 对象和方法
• 2.2.2 结果
• 2.2.3 讨论
• 2.2.4 小结
• 实验三:β-NGF对MIA PaCa-2细胞黏附、运动及侵袭能力影响的研究
• 2.3.1 对象和方法
• 2.3.2 结果
• 2.3.3 讨论
• 2.3.4 小结
• 三、胰腺癌原位移植瘤模型的建立及神经浸润分子机制的探讨
• 实验一、人胰腺癌荷瘤裸鼠原位移植瘤模型的建立及生物学特性研究
• 3.1.1 对象和方法
• 3.1.2 结果
• 3.1.3 讨论
• 3.1.4 小结
• 实验二、β-NGF对胰腺癌细胞侵袭能力影响的分子机制实验研究
• 3.2.1 对象和方法
• 3.2.2 结果
• 3.2.3 讨论
• 3.2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述一
• 裸鼠胰腺癌动物模型及其应用进展
• 综述参考文献
• 综述二
• 胰腺癌浸润转移机制的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢