RNA干扰体外抑制HBeAg表达的实验研究

论文摘要

目的及意义:构建带有绿色荧光蛋白报告基因的哺乳动物 shRNA表达载体和 HBeAg 真核表达载体,两者共转染 Hela 细胞,探讨 shRNA表达载体对 HBeAg 表达的抑制作用,为应用 RNAi 技术治疗乙型肝炎奠定一定的理论基础。方法:本研究采用 PCR 方法从含有人 U6 启动子的载体 PTZU6+1 中扩增 U6 启动子,将其克隆到 pEGFP-C1 载体中,通过限制性内切酶、PCR 及测序对构建的载体进行鉴定,并转染 Hela 细胞,用倒置荧光显微镜初步观察绿色荧光蛋白的表达;采用 PCR 的方法从质粒 PHBV1.5 中扩增乙肝病毒前 C/C 基因,克隆到 pCDNA3.1 的多克隆位点区 EcoRI 和 BamHI 位点,构建 HBeAg 表达载体,通过酶切、PCR及测序鉴定,把质粒转染 Hela 细胞,用 RT-PCR 检测 mRNA 的转录,免疫细胞化学检测HBeAg前体的表达,ELISA和MEIA分别检测细胞裂解液HBeAg 前体和培养上清 HBeAg 的表达;把构建的两载体按 7∶1 的比例共转染 Hela 细胞,用半定量 PCR 和 MEIA 分析 shRNA 表达载体对 HBeAg mRMA 和蛋白质的抑制情况;结果:经限制性内切酶、PCR 及测序证实已成功构建哺乳动物 shRNA 表达载体,该载体可以表达绿色荧光蛋白;成功构建了 HBeAg 表达载体,该载体可以在 Hela 细胞中表达 HBeAg 前体,并且可以分泌表达成熟的 HBeAg;初步筛选到 psiHBV2 载体对 HBeAg的表达有一定的抑制作用,其余两序列无抑制作用;结论:1、成功构建带有绿色荧光蛋白报告基因的哺乳动物 shRNA 表达载体,为应用该载体进行 RNAi 相关研究奠定一定的基础;2、成功构建乙肝病毒 HBeAg表达载体,该载体可以分泌表达 HBeAg,可以胜任 RNA 干扰的靶载体;

论文目录

• 英文缩写及中英文对照
• RNA 干扰体外抑制HBEAG 表达的实验研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 带报告基因 shRNA 表达载体的构建及鉴定
• 一、实验器材
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 第二部分 HBeAg 真核表达载体的构建及表达
• 一、实验器材
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 第三部分 RNAi 在 Hela 细胞中对 HBeAg 表达的抑制作用探讨
• 一、实验器材
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 全文小结
• 本课题的创新点及不足之处
• 图片资料
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文