慢病毒介导HCN2基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

论文摘要

目的：探讨通过超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道2 （hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN2）基因稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）的可行性。探求HCN2转染的最佳感染复数（multiplication of infection, MOI）,为进一步研究起搏电流的电生理学特性提供前期实验基础。方法：1.骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定：采用改良全骨髓贴壁培养的方法分离纯化BMSCs,培养于含20%FBS的DMEM培养基,并传代培养；观察培养细胞的生长状态；通过CD34、CD4、CD45、CD90免疫组织化学和流式细胞技术进行细胞鉴定。应用体外成骨诱导,观察BMSCs向成骨细胞分化的功能特性。2.对购得的HCN2质粒进行扩增和纯化,对纯化质粒行蛋白电泳和基因测序,鉴定HCN2基因。3.重组慢病毒（Feline immunodeficiency virus,FIV）载体HCN2的构建及其鉴定：将鉴定正确的重组慢病毒进行扩增、纯化和滴度测定。以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）基因为信号基因,确定最佳感染复数；观察FIV-EGFP转染BMSCs表达强度随时间的变化情况；流式细胞检测FIV-HCN2转染BMSCs的细胞活力的变化。结果：1.改良全骨髓贴壁分离法法获得了高纯度（>90%）和高活力（>90%）的BMSCs,经形态学观察和免疫组织化学检测,显示所培养细胞呈梭形、纺锤形和多角形,免疫化学染色CD44、CD90阳性,CD34阴性,符合BMSCs的形态和表面标记；流式细胞仪分析,CD44、CD90阳性细胞分别占99.5%、90.9%。体外成骨诱导BMSCs,茜红素染色可见大量钙结节后,说明BMSCs具有向成骨细胞分化能力。2. HCN2的质粒扩增方法可靠,扩增的质粒经双酶切证实基因片段大小正常,目的基因测序结果证实与GeneBank上基本一致。3.重组慢病毒HCN2的构建。使用包装病毒上清液做慢病毒滴度检测未见荧光；用上清液感染BMSCs,24h、48h、72h也未检测出有意义的绿色荧光。结论：1.采用改良全骨髓贴壁法,可分离获得较高纯度、高活力的BMSCs。BMSCs体外增殖速度快,可短期内达到实验所需要细胞数量。2.含有HCN2的质粒扩增方法可靠,扩增的质粒经双酶切证实基因片段大小正常,目的基因测序结果证实与GeneBank上基本一致。3.重组慢病毒HCN2转染干细胞有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 主要英文缩略词表
• 致谢
• 心肌组织工程种子细胞的研究进展（综述）
• 参考文献
• 心肌组织工程支架材料研究进展（综述）
• 参考文献