东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因克隆及其功能研究

论文摘要

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE, EC 3.1.1.7）是分布于脊椎动物胆碱能神经节、线虫及无脊椎动物神经肌肉接头处的重要水解酶。在生物体内,它能特异性催化乙酰胆碱的水解反应,终止神经递质对突触后膜的兴奋作用,保证神经信号在生物体内的正常传递。由于有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂能特异性抑制乙酰胆碱酯酶的活性,阻断乙酰胆碱的水解,使乙酰胆碱在突触间隙积累并引起昆虫中毒死亡,因此乙酰胆碱酯酶是有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis, Meyen）是我国重点防治的迁飞性农牧业害虫。目前,有机磷杀虫剂仍然是杀灭东亚飞蝗的主要化学农药。在长期的选择压力下,东亚飞蝗有机磷杀虫剂抗性种群已经产生。对东亚飞蝗自然种群乙酰胆碱酯酶敏感性的对比研究结果显示:抗性种群乙酰胆碱酯酶对毒死蜱、内吸磷、对硫磷的敏感性分别是敏感种群的62倍、2.0倍和1.6倍。因此,不敏感型乙酰胆碱酯酶很可能是引起东亚飞蝗杀虫剂抗性的机制。尽管不敏感型乙酰胆碱酯酶已被证明是引起许多昆虫抗药性的重要机制,但对东亚飞蝗而言,由于未知其乙酰胆碱酯酶基因序列,因此不敏感型乙酰胆碱酯酶产生的分子生物学机制尚不清楚。本研究通过比对昆虫乙酰胆碱酯酶蛋白质序列,找出其氨基酸保守区域,兼顾东亚飞蝗密码子使用频率,设计简并引物,PCR扩增东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因保守片段;以东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因保守序列为依据,设计基因特异性引物,采用RACE技术扩增东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶cDNA全长;在得到东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶cDNA全长的基础上,通过基因干扰和基因表达研究东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的功能。东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因的克隆及其功能研究,有助于从分子水平上阐明东亚飞蝗有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂抗性产生的分子生物学机制,对于开发新型化学及生物杀虫剂具有十分重要的意义。1.乙酰胆碱酯酶基因的克隆以东亚飞蝗基因组DNA为模板,用根据乙酰胆碱酯酶保守序列设计的简并引物进行PCR实验,获得了一个263 bp的基因片段。生物信息学分析表明,该片段编码的氨基酸序列与德国小蠊（Blattella germanica）AChE1有93%的相似性,与嗜卷书虱（Liposcelis bostrychophila） AChE有90%的相似性,与黑尾叶蝉（Nephotettix cincticeps）AChE2有89%的相似性。在东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶保守序列基础上,设计基因特异性引物,采用RACE技术克隆了东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因,登录到GenBank,登录号为EU231603。克隆到的东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因cDNA序列长2255bp,开放阅读框长1638bp,共编码546个氨基酸,5′-和3′-端非编码区分别长286bp和328bp。进化树分析表明,该基因的编码产物属于Ⅰ型乙酰胆碱酯酶,其一级结构具有如下乙酰胆碱酯酶的共同特征:①保守的催化三联体活性位点,即S151（S200 in Torpedo）,E277（327）和H391（440）;②胆碱结合位点W36（W84 in Torpedo）;③形成链内二硫键的6个半胱氨酸（C67-C94、C254-C265、C402-C521 in Torpedo）,东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶有5个保守的半胱氨酸（C26, C205–C218和C353–C519）,缺乏形成第一个链内二硫键的第一个半胱氨酸;④形成催化谷内衬的14个芳香族氨基酸残基（Y70、W84、W114、Y121、Y130、W233、W279、F288、F290、F330、F331、Y334、W 432和Y442 in Torpedo）,有12个在东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶中保守（W36、W66、Y73、Y82、W184、W232、F240、F242、F280、F281、Y284和W 373）;⑤包含丝氨酸活性位点的FGESAG序列,该序列在所有胆碱酯酶中保守。2.东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶与有机磷抗性之间的关系将体外转录制备的乙酰胆碱酯酶基因特异性dsRNA注射到东亚飞蝗四龄若虫血腔,检测dsRNA介导的基因沉默情况。实时荧光定量PCR结果显示,在mRNA水平上,乙酰胆碱酯酶基因表达下调了46.14%;ELISA结果显示,在蛋白质水平上,乙酰胆碱酯酶基因表达下调了47.36%;酶活测定结果显示,乙酰胆碱酯酶基因干扰组东亚飞蝗的乙酰胆碱酯酶比活是对照组的40%。说明RNA干扰能特异性沉默东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因的表达。马拉硫磷敏感性测定结果显示,干扰组蝗虫半数致死剂量LD50为1.73μg/头,对照组LD50为4.34μg/头,两者存在显著性差异（p<0.05）。该结果提示乙酰胆碱酯酶基因干扰会引起东亚飞蝗马拉硫磷敏感性增加,说明该乙酰胆碱酯酶是有机磷杀虫剂作用靶标和东亚飞蝗有机磷杀虫剂抗性相关基因。3.东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的表达构建了东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶真核表达载体,获得了高表达毕赤酵母菌株,经2.5%甲醇诱导培养九天,其表达量可达500μg·mL-1。毕赤酵母表达上清经50%饱和度硫酸铵沉淀和His-Tag亲和层析后,可以获得纯净的重组乙酰胆碱酯酶,其比活可达8.1U·mg-1。对重组乙酰胆碱酯酶的酶学特性研究显示,该酶对硫代乙酰胆碱的催化活性高于硫代丁酰胆碱,其催化硫代乙酰胆碱水解的Km为67.77μM;毒扁豆碱和BW284C51能特异性抑制重组乙酰胆碱酯酶的活性,当抑制剂的浓度为1×10-4mol·L-1时,酶活可分别被抑制69%和76%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 研究背景与意义
• 1.2 乙酰胆碱酯酶基因研究进展
• 1.2.1 乙酰胆碱酯酶基因的克隆
• 1.2.2 乙酰胆碱酯酶基因的表达
• 1.3 乙酰胆碱酯酶的结构
• 1.4 乙酰胆碱酯酶的功能
• 1.5 昆虫ACE 的分子进化
• 1.6 昆虫乙酰胆碱酯酶与有机磷杀虫剂抗性
• 1.6.1 代谢抗性
• 1.6.2 靶标抗性
• 1.7 研究目标和整体思路
• 1.7.1 研究目标
• 1.7.2 整体思路
• 1.8 研究内容和技术路线
• 1.8.1 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因的克隆及序列分析
• 1.8.2 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因的原核表达与抗体制备
• 1.8.3 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶真核表达载体的构建与表达
• 1.8.4 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶RNA 干扰
• 1.9 本研究的创新性
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 溶液配制?
• 2.2.1 分子生物学实验溶液的配制
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 蛋白质SDS-PAGE 溶液配制
• 2.2.4 包涵体洗涤、纯化溶液的配制
• 2.2.5 乙酰胆碱酯酶活性测定底物-显色剂溶液
• 2.2.6 Western blot 试剂
• 2.3 东亚飞蝗ACE 基因克隆
• 2.3.1 ace 保守序列的PCR 扩增、克隆及序列测定
• 2.3.2 3'-RACE 和5'-RACE 克隆ace 3'-端和5'-端cDNA 序列
• 2.3.3 Lm-AChE cDNA 全长序列的克隆
• 2.3.4 AChE 基因的Southern 杂交分析
• 2.4 东亚飞蝗RNAI
• 2.4.1 dsRNA 的合成
• 2.4.2 dsRNA 的注射
• 2.4.3 RNA 干扰效果检测
• 2.5 抗LM-ACHE 血清的制备
• 2.5.1 Lm-AChE 片断在大肠杆菌（BL21）中的融合表达
• 2.5.2 包涵体制备与纯化
• 2.5.3 蛋白染色方法
• 2.5.4 鼠抗Lm-AChE 血清的制备
• 2.5.5 鼠抗Lm-AChE 血清效价测定
• 2.5.6 鼠抗Lm-AChE 血清Western-blotting 分析
• 2.6 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中的表达
• 2.6.1 重组表达质粒AChE-pPIC9K 的构建
• 2.6.2 电激法转化Pichia pastoris KM71
• 2.6.3 重组AChE 高表达毕赤酵母菌株的筛选
• 2.6.4 重组AChE 的纯化
• 2.6.5 重组AChE 酶学特性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 东亚飞蝗ACE 基因克隆和分析
• 3.1.1 东亚飞蝗ace 基因保守片段的克隆和分析
• 3.1.2 5' RACE 和3' RACE 克隆ace 5'-端和3'-端序列
• 3.1.3 东亚飞蝗ace 的分析
• 3.2 东亚飞蝗 ACHE 系统进化
• 3.3 东亚飞蝗若虫RNAI
• 3.3.1 DNA 模板
• 3.3.2 dsRNA 的制备
• 3.3.3 东亚飞蝗若虫RNAi
• 3.3.4 若虫RNAi 效果分析
• 3.4 抗LM-ACHE 血清的制备
• 3.5 东亚飞蝗重组乙酰胆碱酯酶的酶学特性
• 3.5.1 乙酰胆碱酯酶高表达菌株的筛选
• 3.5.2 乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中的表达
• 3.5.3 重组乙酰胆碱酯酶的纯化
• 3.5.4 重组乙酰胆碱酯酶活性与pH 的关系
• 3.5.5 重组乙酰胆碱酯酶活性与温度的关系
• 3.5.6 重组乙酰胆碱酯的动力学特性
• 3.5.7 重组乙酰胆碱酯的抑制特性
• 4 讨论
• 4.1 东亚飞蝗 ACHE 基因
• 4.1.1 东亚飞蝗AChE 基因的克隆
• 4.1.2 东亚飞蝗AChE 基因的特点
• 4.1.3 东亚飞蝗AChE 基因的功能
• 4.1.4 东亚飞蝗AChE 与抗药性
• 4.2 BIOASSAY 在东亚飞蝗抗性研究中的应用
• 4.3 RNAI 在东亚飞蝗研究中的应用
• 5 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A 博士期间论文发表情况
• B 电鳐乙酰胆碱酯酶一级结构