论文题目: 一种抗肿瘤蛋白基因在衣藻叶绿体中的重组与表达
论文类型: 博士论文
论文专业: 细胞生物学
作者: 苏忠亮
导师: 钱凯先,秦松
关键词: 莱茵衣藻,叶绿体转化,别藻蓝蛋白基因,别藻蓝蛋白亚基基因,别藻蓝蛋白
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 我们实验室于1998年从蓝藻中克隆获得了别藻蓝蛋白基因(apc)。将该基因重组到大肠杆菌表达质粒PET28a+中,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达。纯化的产物(rAPC)经小鼠试验证实,不管是口服给药还是腹腔注射给药,微量的该重组蛋白便可显著抑制S180肉瘤细胞和肝癌细胞,抑瘤率为40%-60%。但在大肠杆菌中表达的重组蛋白存在后期的分离纯化繁琐,需要包涵体复性以及含有大肠杆菌毒素等不利因素。由于rAPC口服给药有效,这提示我们可以开发一种直接口服的治疗癌症的新药。由于植物表达系统具有高效表达外源目的基因、生物安全性好、可以直接口服等特点,已成为生物反应器的热点之一。别藻蓝蛋白基因来源于原核的蓝藻,密码子的偏好性等均具有原核性质,因此我们选择了用衣藻叶绿体表达系统来表达这种药用蛋白。为进一步开发口服抗肿瘤药用蛋白奠定基础。 本论文研究的第一部分探索了进行衣藻叶绿体转化所涉及的各种方法,如:基因枪转化参数、筛选方法及对转化子的各种分子检测方法等。通过对以上方法的探索,初步建立了利用同源重组方法在衣藻叶绿体中稳定表达外源基因的体系。 本论文研究的第二部分构建了外源基因apc的衣藻叶绿体表达载体:papc-S,并用基因枪法将该载体导入衣藻细胞,通过抗性筛选后,在壮观霉素抗性平板上得到了15个墨绿色的衣藻转化子。经过三轮抗性筛选后,利用一对分别互补于衣藻叶绿体chlL,基因5’端和外源基因apc 3’端的引物对转化子进行了PCR检测,同时以apc基因为探针对转化子进行了酶切Southern检测,结果证实外源基因已经定点整合到了衣藻叶绿体特定位点。以天然APC蛋白免疫兔获得的抗血清为一抗,经Western杂交证实外源基因已在衣藻叶绿体中获得了表达,经定量ELISA检测证实外源基因在衣藻中的表达量占可溶性总蛋白的2—3%。 由于在大肠杆菌中重组的别藻蓝蛋白β亚基的抗肿瘤活性大大高于完整的重组的APC蛋白。因此论文研究的第三部分构建了别藻蓝蛋白β亚基的衣藻叶绿体表达载体papc-B。用基因枪法将之导入衣藻细胞后,经各种分子水平的检
论文目录:
中文摘要
Abstract
本论文的创新点
第一章：文献综述
第一节：藻胆蛋白
1．藻胆蛋白的结构及能量传递
2、藻胆蛋白活性研究
3、藻胆蛋白的应用研究
4、藻胆蛋白基因工程
第二节：微藻基因工程研究进展
1、蓝藻的基因工程研究进展
2、真核微藻基因工程研究进展
第二章：衣藻转化体系的建立
第一节：衣藻叶绿体转化体系的建立
1、材料与方法
2、结果与分析
第二节：讨论
1、衣藻受体细胞的准备
2．转化子的筛选方法
第三章：别藻蓝蛋白基因在衣藻叶绿体中的表达
第一节：含别藻蓝脱辅基蛋白基因的衣藻叶绿体转化载体的构建
1、材料与方法
2、结果与讨论
第二节：别藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因(apc)在衣藻叶绿体中的表达
1、材料与方法
2、结果
第三节 讨论
第四章：别藻蓝脱辅基蛋白β亚基基因在衣藻叶绿体中的表达
1、含别藻蓝蛋白β亚基基因的衣藻叶绿体表达载体的构建
1．1、材料与方法
1．2、结果
2、别藻蓝蛋白β亚基基因在衣藻叶绿体中的表达
2．1、材料与方法
2．2、结果
3、讨论
参考文献
读博期间发表的文章
附录 衣藻培养基及培养条件
发布时间: 2005-10-10
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