锯缘青蟹呼肠孤病毒部分基因序列的测定及其RT-LAMP检测方法的建立

论文摘要

锯缘青蟹呼肠孤病毒（Scylla serrata reovirus, SsRV）是青蟹中最常见的病毒性病原体之一,该病原引起的疾病在中国东南沿海普遍存在并广泛流行,造成了巨大的经济损失。本研究运用石蜡切片及超薄切片技术,对感染SsRV病毒的锯缘青蟹组织进行组织病理和超微观察。石蜡切片结果显示：SsRV病毒的侵染导致青蟹的肝胰腺、鳃、肠、心、胃和肌肉组织中产生明显组织病理变化,其中以肝胰腺、鳃组织和肠组织的病理变化最为明显,主要包括肝胰腺基底膜破损、肝细胞坏死、鳃腔堵塞、肠上皮细胞脱落、心肌与足肌纤维排列紊乱、断裂等。超薄切片结果显示：SsRV在肝胰腺、鳃、肠和心等组织广泛分布,说明SsRV组织嗜性广泛；SsRV可导致靶器官细胞核染色质凝结、电子密度增高、髓样小体和溶酶体产生、线粒体组织结构破坏和粗面内质网扩张变形等明显细胞病理学变化。利用差速离心和蔗糖密度梯度高速离心相结合的方法,从患病锯缘青蟹中成功分离获得SsRV病毒,完整的病毒粒子直径为70 nm,球形,无囊膜,表面光滑,无棘突,20面体对称,基因组由13个dsRNA节段组成,PAGE电泳带型特点为1/5/7,分子量约为25 kb。利用单引物扩增法（Single primer amplification technique, SPAT）成功获得了SsRV基因组S1、S2、S3、S7、X1、X2、X3和X4节段,长度分别为4327 nt、2721 nt、2715 nt、1517 nt、2460 nt、1255 nt、1244 nt和1155 nt。序列分析结果显示,所有节段的5’和3’端保守序列均分别为5’-AUAAAU.....和......AACGAU-3’,并且末端的寡核苷酸互补,与呼肠孤病毒基因组特征一致。S1、S2、S3、S7、X2、X3和X4均含有单一的开放阅读框,分别编码分子量为160 kDa,100 kDa,96kDa,46kDa, 40kDa,36 kDa和30 kDa的蛋白质,而X1节段含有2个阅读框,编码两个分子量大小不同的蛋白质（32 kDa和25 kDa）。Blastp同源性搜索及生物信息学分析结果显示,S1和S2节段分别为病毒的依赖RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase, RdRp）和鸟苷酸转移酶（guanylyltransferase）。由于其他节段与呼肠孤病毒成员无同源性,他们编码病毒的何种蛋白未知。基于RdRp氨基酸序列构建的遗传进化树显示,SsRV虽然与15个已定病毒属成员具有共同的进化祖先,但形成新的分枝。上述研究结果表明,SsRV病毒可能属于呼肠孤病毒科的一个新属。将S7、X2、X3和X4的开放阅读框（open reading frame, ORF）亚克隆到pET30a（+）载体上,获得重组表达质粒pET30/1517-ORF、pET30/1255-ORF、pET30/1244-ORF和pET30/1155-ORF,分别将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21 （DE3）,筛选获得阳性重组子,序列测定表明目的基因准确地插入到表达载体的BamH I/Hind III位点。pET30/1255-ORF和pET30/1255-ORF经IPTG诱导分别表达出48kDa、36kDa的融合蛋白,SDS-PAGE和westerm-blot分析显示上述表达产物的分子量与预期的pET30/1255-ORF融合蛋白和pET30/1255-ORF的融合蛋白分子量相符,且能被抗SsRV多克隆抗体特异的识别。而pET30/1517-ORF和pET30/1244-ORF未能在E. coli BL21 （DE3）中成功表达。本研究将一种新型的核酸扩增技术—逆转录环介导等温扩增技术（reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）应用于SsRV病毒的早期检测。对3种病毒进行RT-LAMP扩增,仅SsRV得到阳性扩增结果,证明RT-LAMP具有很高的特异性。SsRV dsRNA的检测灵敏度为0.8fg,是一步逆转录多聚酶链反应（one step reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）灵敏度的1000倍。结果表明,本研究建立了一种特异、灵敏、简便的用于SsRV快速检测的RT-LAMP技术。

论文目录

摘要

Abstract

缩略语表

第1章文献综述

1 呼肠孤病毒科简介

2 水生动物呼肠孤病毒研究概况

3 锯缘青蟹病毒性疾病

4 病毒基因测定方法

5 水产动物病毒病分子生物学检测技术

5.1 核酸杂交技术

5.2 聚合酶链反应技术

5.3 基因芯片技术

5.4 环介导的等温扩增技术

6 本论文研究目的与意义

第2章感染呼肠孤病毒的锯缘青蟹组织病理观察及病毒纯化

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 工具酶及试剂

2.3 常用缓冲液及试剂配制

2.4 光镜样品制备及观察

2.5 电镜样品制备及观察

2.6 病毒粒子纯化与负染观察

2.7 RNA提取

2.8 核酸的PAGE电泳

3 结果与分析

3.1 肉眼观察

3.2 石蜡切片观察

3.3 超薄切片观察

3.4 负染结果观察

3.5 核酸电泳图谱分析

3.6 核酸特性分析

4 讨论

第3章锯缘青蟹呼肠孤病毒部分基因序列的测定

1 前言

2 材料与方法

2.1 病毒、质粒及载体

2.2 工具酶及试剂

2.3 常用缓冲液及试剂配制

2.4 引物设计

2.5 SsRV病毒基因的克隆

3 结果与分析

3.1 SsRV获得扩增序列的节段

3.2 SsRV病毒核苷酸序列分析

3.3 SsRV病毒RdRp系统进化分析

3.4 SsRV病毒基因组密码子偏爱性分析

3.5 SsRV病毒基因推导氨基酸序列分析

4 讨论

第4章锯缘青蟹呼肠孤病毒部分基因的原核表达

1 前言

2 材料与方法

2.1 菌株及质粒

2.2 工具酶及试剂

2.3 常用缓冲液及试剂配制

2.4 引物设计

2.5 碱裂解法小量提取重组质粒

2.6 BL21感受态细胞的制备

2.7 构建ORF的原核表达载体

2.8 ORF重组蛋白的表达和纯化

2.9 SsRV多克隆抗体制备

2.10 Western免疫印迹检测ORF表达蛋白

3 结果与分析

3.1 ORF的原核表达载体的构建

3.2 表达体系的优化

3.3 ORF的原核表达蛋白的纯化

3.4 SsRV多克隆抗体制备

3.5 表达蛋白Western-blot鉴定

4 讨论

第5章锯缘青蟹呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立

1 前言

2 材料与方法

2.1 病毒来源

2.2 工具酶及试剂

2.3 常用缓冲液及试剂配制

2.4 引物设计

2.5 SsRV dsRNA的提取

2.6 RT-LAMP反应体系的建立

2.7 RT-LAMP和RT-PCR检测灵敏度的对比

2.8 RT-LAMP方法的应用

3 结果和分析

3.1 RT-LAMP反应体系的设置

3.2 RT-LAMP最佳反应时间的确定

3.3 RT-LAMP最佳反应温度的确定

3.4 RT-LAMP反应体系最佳参数的确定

3.5 RT-LAMP特异性分析

3.6 RT-LAMP和RT-PCR检测灵敏度的对比

3.7 RT-LAMP方法的应用

4 讨论

4.1 引物设计与特异性

4.2 SsRV RT-LAMP的设置与体系优化

4.3 SsRV RT-LAMP的灵敏性

4.4 LAMP用于SsRV检测的意义

参考文献

附录1

附录2

附录3

附录4

致谢

锯缘青蟹呼肠孤病毒部分基因序列的测定及其RT-LAMP检测方法的建立

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