棉花胞质雄性不育恢复基因的精细定位和物理作图

论文题目: 棉花胞质雄性不育恢复基因的精细定位和物理作图

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 殷剑美

导师: 张天真

关键词: 棉花,胞质雄性不育,恢复基因,精细定位,物理作图

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 棉花是世界上重要的经济作物之一，提供人类多数纤维与部分油料来源。棉花杂种优势十分明显，可有效提高产量、纤维品质与抗病、抗逆性。细胞质雄性不育在作物杂种优势利用、研究质核互作等方面有着重要的意义。目前，利用棉花CMS的三系配套培育出了一些杂交种应用于生产，但总体来说，由于恢复系本身产量水平低以及不育系外来细胞质的有害性等原因使得棉花CMS的应用受到极大的限制。随着分子遗传学和现代生物技术的迅速发展，在主要作物中，胞质不育系的研究已从生理生化的全面探讨深入到分子水平。本文选用2532对SSR引物，利用含有447个单株的3个BC1群体[湘-A×（湘-A×0-613-2R）、ZMS12A-3×（ZMS12A-3×0-613-2R）、太121A-2×（太121A-2×0-613-2R）]对恢复基因进行分子标记筛选。共筛选到5个SSR标记与Rf1紧密连锁。再整合别人已筛选到的Rf1紧密连锁分子标记（3个SSR，2个RAPD和3个STS标记），利用Mapmaker软件对恢复基因进行精细作图。图谱共含8个SSR标记，2个RAPD标记和3个STS标记，连锁图总的遗传距离小于1.0cM。其中，2个RAPD引物（NAU／RAPD／Rf13和NAU／RAPD／Rf15）和4个SSR引物（NAU／SSR/1824、NAU／SSR／1034、NAU／SSR／441和NAU／SSR/211-215）表现为共分离，另外3个SSR引物（NAU／SSR/790、NAU／SSR/1782和NAU／SSR/167）与3个STS引物（STS/UBC147、STS／UBC679和STS／UBC659）的遗传距离也为0cM，而它们之间的遗传距离为0.2cM。细菌人工染色体（BAC）文库是基因组物理图谱、图位克隆和基因组测序的重要工具。为了构建棉花基因组物理图谱并图位克隆棉花基因，高质量的大片段插入文库是必要的。本研究选用了一个遗传稳定的棉花哈克尼西棉胞质雄性不育的恢复系，0-613-2R，通过低熔点琼脂糖包埋法提取了棉花的基因组DNA，分子量约在1Mb左右，碎片较少，基本上无蛋白质和细胞器DNA等污染。所构建的棉花恢复系BAC文库，共包括97，825个单克隆，保存于255块384孔培养板中。随机挑取单克隆检测

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

本文所用缩略词

第一部分文献综述

第一章植物雄性不育的研究

1 植物雄性不育的类型

2 植物胞质雄性不育(CMS)分子机理的研究

2.1 叶绿体DNA(cpDNA)及其产物与CMS

2.2 线粒体DNA(mtDNA)及其产物与CMS

2.3 核质互作与CMS

3 基因工程创造雄性不育

4 棉花细胞质雄性不育(CMS)的研究

5 恢复基因的克隆

第二章图位克隆(Map-based Cloning)

1 图位克隆的技术步骤

1.1 筛选与目标基因连锁的分子标记

1.1.1 随机扩增多态性DNA

1.1.2 微卫星DNA

1.1.3 STS(Sequence Tagged Sites)

1.2 目的基因区域的精细作图(Fine Map)

1.3 构建物理图谱(Physical Map)

1.4 克隆基因(Gene Cloning)

2 物理图谱(Physical Map)的构建

2.1 物理图谱的构建策略

2.1.1 菌落杂交

2.1.2 PCR技术

2.2 构建物理图谱的关键要素

2.2.1 克隆载体

2.2.2 克隆末端分离技术

2.2.3 染色体行走技术

2.3 物理图谱研究进展

第三章基因组文库的构建

1 基因组文库

1.1 基因组文库的概念

1.2 基因组文库的类型

2 细菌人工染色体(BAC)文库

2.1 BAC文库的优点

2.2 BAC文库的载体

2.2.1 pBeloBACll载体

2.2.2 pIndigoBAC-5载体

2.2.3 双元T-DNA载体BIBAC(Binary BAC library)

2.3 BAC克隆策略

2.4 BAC的应用

2.5 棉花BAC文库的研究进展

3 研究目的与意义

第二部分研究报告

第四章棉花胞质雄性不育(CMS)恢复基因的精细作图

Ⅰ 材料与方法

1 材料

1.1 遗传作图材料

1.2 分子标记的种类及其来源

1.2.1 SSR标记

1.2.2 RAPD标记

1.2.3 STS标记

2 方法

2.1 育性调查

2.2 棉花基因组DNA(微量)的提取

2.3 分子标记分析

2.3.1 SSR分析

2.3.2 RAPD分析

2.3.3 STS分析

2.4 遗传图谱的构建

Ⅱ 结果与分析

1 BC_1群体遗传分析

2 分子标记分析

2.1 SSR分析

2.2 RAPD分析

2.3 STS分析

2.4 分子标记来源及特征带大小

3 Rf_1基因紧密连锁图谱的构建

Ⅲ 讨论

1 精细作图的影响因素

1.1 表型鉴定的准确性

1.2 双亲之间的遗传差异

1.3 作图群体大小

2 育性恢复基因紧密连锁标记的应用

2.1 MAS应用

2.2 图位克隆应用

第五章棉花CMS恢复系细菌人工染色体(BAC)基因组文库的构建

Ⅰ 材料与方法

1 材料

2 方法

2.1 棉花高分子量核DNA的制备

2.1.1 叶片的准备

2.1.2 细胞核的分离

2.1.3 胶块的制备

2.1.4 胶块质量的检测

2.2 部分酶切最佳酶用量的确定

2.2.1 酶切缓冲液(1)

2.2.2 酶切缓冲液(2)

2.2.3 确定部分酶切最佳酶用量

2.3 大片段DNA的大量酶切

2.4 酶切DNA片段的大小选择

2.5 电洗脱回收大片段DNA

2.6 大片段DNA与载体DNA的连接

2.7 连接产物的转化

2.8 单克隆文库及混合克隆文库的构建

2.9 BAC文库的分析

2.9.1 文库质量的分析

2.9.2 BAC单克隆稳定性的检测

2.10 细菌质粒DNA(微量)的提取

2.10.1 单个离心管(1.5ml)提取BAC质粒DNA

2.10.2 96孔板提取细菌质粒DNA

2.11 主要试剂

Ⅱ 结果与分析

1 棉花基因组文库的构建

1.1 棉花高分子量核DNA的制备

1.1.1 幼苗的避光培养

1.1.2 防氧化处理

1.1.3 不溶性杂质的去除

1.2 酶切片段的选择

1.3 电洗脱回收DNA

1.4 连接与转化

1.5 单克隆的挑取

2 BAC文库的质量分析

2.1 插入片段大小

2.2 BAC单克隆稳定性

Ⅲ 讨论

1 棉花基因组文库构建的方法

1.1 棉花高分子量基因组DNA的制备

1.2 目的片段的二次选择

1.3 目的片段DNA的回收

1.4 Not Ⅰ酶切位点

2 棉花BAC文库的优点与作用

2.1 BAC的优点

2.2 BAC文库的作用

2.2.1 基因的图位克隆

2.2.2 开发新的分子标记

2.2.3 BAC-FISH(Fluorescence in situ hybridization)的应用

第六章棉花CMS恢复基因的物理作图

Ⅰ 材料与方法

1 材料

1.1 BAC文库

1.2 分子标记

1.3 限制性内切酶

2 方法

2.1 分子标记分析

2.2 质粒的提取

2.3 PCR法筛选BAC文库

2.3.1 PCR法筛选文库策略

2.3.2 PCR筛选BAC文库

2.4 重叠群构建

2.5 BAC末端测序

2.6 BAC末端序列的引物设计

2.7 新标记的增加

Ⅱ 结果与分析

1 分子标记筛选

1.1 SSR筛选

1.2 RAPD筛选

1.3 STS筛选

2 限制性酶切图谱的构建

2.1 Not Ⅰ酶切

2.2 HindⅢ酶切

2.3 重叠群(Contig)的构建

2.4 BAC末端测序

2.5 精细图谱的构建

Ⅲ 讨论

1 BC_1作图群体的效率

2 PCR法筛选BAC文库的可行性

3 BACs的指纹图谱

4 重叠群(Contig)的构建

5 BACs末端测序

6 增加了新的分子标记

7 CMS细胞质雄性不育育性恢复机理探讨

全文结论

参考文献

附录

致谢

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发布时间: 2006-10-20

棉花胞质雄性不育恢复基因的精细定位和物理作图

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