论文摘要
目的:研究TGF-β1及RAS相关基因ACE及AT1R基因多态性与腰椎间盘突出症中医证型的关联性,寻找椎间盘退变、腰椎间盘突出症主要中医证型的易感基因,探讨基因辅助辨证的可行性,为今后进一步研究中医药基因诊疗本病提供参考。方法:1.根据胡有谷主编的《腰椎间盘突出症》以及陆裕朴等主编的《实用骨科学》中腰椎间盘突出症的诊断标准,结合病例选择标准、病例纳入及排除标准,随机选择临床确诊为腰椎间盘突出症的患者118例作为病例组,其中汉族63例、壮族55例,同时根据国家中医药管理局1994年批准的行业标准“腰椎间盘突出症的诊断标准、症候分类、疗效标准”及中华人民共和国卫生部2002年制定的“中药新药治疗腰椎间盘突出症的临床研究指导原则”对118例腰椎间盘突出症进行分型,其中符合血瘀证38例、寒湿证29例、肝肾亏虚证31例、湿热证20例。健康对照组119例,汉族64例、壮族55例,均来源于医院健康体检中心,并根据既定选择、纳入及排除标准进行筛选,选取与病例组年龄、性别等相匹配的健康人群。2.以面访方式收集研究对象的年龄、性别、民族属性、腰椎负荷强度（职业）以及家族史,计算并记录样本个体的体重指数、吸烟指数,并根据MRI影像表现评估椎间盘的退变程度等相关指标。3.抽取研究对象静脉血2ml作为检测样本,检测指标包括TGF-β1基因-509C/T及-800G/A多态性、ACE基因I/D及AT1R基因A1166C多态性,均运用聚合酶链反应结合限制片段长度多态酶切技术进行基因多态性检测并对其进行基因分型,主要实验步骤包括外周血白细胞DNA的提取、聚合酶链反应扩增、限制性内切酶消化、凝胶电泳、检测扩增结果及读取各个体基因型等。4.采用频率计数法计算各位点的基因型与等位基因频率,组间基因型与等位基因频率比较均采用卡方检验或四格表确切概率法,两组均数比较采用t检验,比值比（oddratio,OR）、交互作用采用Logistic回归分析计算,相关性应用秩相关分析。所有数据均运用SPSS 13.0 For Windows统计软件包进行统计分析。结果:1.TGF-β1基因-509位点及-800位点、ACE基因、AT1R基因1166位点DNA片段PCR扩增均获得成功,其中TGF-β1基因-509位点PCR扩增产物经SauⅠ酶消化,电泳后根据消化片段大小检出纯合子CC、杂合子CT及纯合子TT三种基因型;TGF-β1基因-800位点PCR扩增产物经Tsp45Ⅰ酶消化,根据消化片段大小检出GG纯合子一种基因型;依据PCR反应产物片段,经电泳证实,ACE基因检测到Ⅱ插入纯合型、DD缺失型及ID插入杂合子3种基因型。AT1R基因1166位点PCR扩增产物经DdeⅠ酶消化,根据电泳条带大小检出AA纯合子及AC杂合子两种基因型。2.病例组TGF-β1基因-800位点的基因型与健康对照组相同,病例组TGF-β1基因-509C/T多态性及AT1R基因A1166C多态性的分布不同于健康对照组,但组间比较无明显差异（P＞0.05）,病例组ACE基因I/D多态性分布与对照组比较有统计学意义（P＜0.05）,TGF-β1基因-509C/T多态性、ACE基因I/D多态性及AT1R基因A1166C多态性与椎间盘的退变程度相关（P＜0.05）,AT1R基因A1166C多态性分布在病例组内汉族及壮族比较差异有统计学意义（P＜0.05）。3.TGF-β1基因-509多态性、ACE基因I/D多态性、AT1R基因A1166C多态性与重度腰椎负荷强度的累积暴露和腰椎间盘突出症发生的风险增加相关（P＜0.01）。4.腰椎间盘突出症血瘀证组TGF-β1基因-509位点CT基因型频率高于非血瘀证组（P＜0.05）;腰椎间盘突出症寒湿证TGF-β1-509位点基因型及C/T等位基因频率分布与肝肾亏虚证比较差异有统计学意义（P＜0.05）,寒湿证汉族与壮族比较TGF-β1-509位点基因型及C/T等位基因分布频率差异也有统计学意义（P＜0.05）;腰椎间盘突出症肝肾亏虚组Ⅱ型ACE基因频率高于非肝肾亏虚证组（P＜0.05）,肝肾亏虚组内壮族携带ACE基因Ⅰ等位基因频率高于汉族;在病例组中,壮族AT1R基因A1166C位点AA基因型频率明显高于汉族（P＜0.05）,寒湿证腰椎间盘突出症AC基因型频率高于血瘀证组（P＜0.05）。5.同时携带TGF-β1基因-509位点CT基因型和ID型ACE基因以及重度腰椎负荷强度者患腰椎间盘突出症血瘀证风险较高（P＜0.01）;同时携带AT1R基因1166位点AC基因型和TGF-β1基因-509位点CC基因型可使个体患寒湿证腰椎间盘突出症的风险增加（P＜0.05）;个体携带Ⅱ型ACE基因可增加肝肾亏虚证腰椎间盘突出症的患病风险（P＜0.01）。结论:1、TGF-β1基因-509C/T及AT1R基因A1166C多态性均非腰椎间盘突出症独立危险因素,ACE基因I/D多态性是腰椎间盘突出症的危险因素之一,腰椎疾患家族史、体质指数及腰椎负荷强度（职业）是腰椎间盘突出症的主要危险因素;2、TGF-β1基因-509C/T、ACE基因I/D及AT1R基因A1166C多态性与腰椎间盘的退变程度相关,携带TGF-β1基因-509位点CT基因型、DD型ACE基因及AT1R基因1166位点AC基因型存在椎间盘退变程度加重的风险,即TGF-β1基因与RAS相关基因参与了腰椎间盘的退变进程,ACE基因I/D多态性与腰椎间盘突出症的发生有一定关系;3、TGF-β1基因-509位点CT基因型是腰椎间盘突出症血瘀证的易感基因,重度腰椎负荷强度也是腰椎间盘突出症血瘀证发生的危险因素之一;4、Ⅱ型ACE基因是腰椎间盘突出症肝肾亏虚证发生的易感基因;5、同时携带AT1R基因1166位点AC基因型和TGF-β1基因-509位点CC基因型的个体可增加腰椎间盘突出症寒湿证发生的风险;6、腰椎间盘突出症血瘀证以TGF-β1基因-509位点CT基因型为主,携带TGF-β1基因-509位点CT基因型椎间盘退变也较严重,两者间有否关联有待研究;7、ACE基因I/D多态性是广西汉族及壮族人群腰椎间盘突出症的遗传易感性基因标志;8、TGF-β1基因-800位点与广西汉族及壮族腰椎间盘突出症中医证型没有关联。本课题为腰椎间盘突出症中医证候辨证从分子水平方面研究提供了一定的实验及临床依据,并为今后进一步研究奠定了基础。相关机制以及有关结论能否成为腰椎间盘突出症中医辨证的客观指标,有待于扩大样本量后更深入地研究。
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