一种新型抗菌肽Cecropin B基因的设计、合成及在毕赤酵母中的表达

论文摘要

抗菌肽（anti-bacterial peptides,简称ABP）是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽,是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障,其生成和释放是机体炎症反应的组成部分。抗菌肽不仅对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌具有高效广谱的杀灭能力,而且对某些病毒、真菌和原虫也具有抑杀作用;同时对一些肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,但对正常哺乳动物和昆虫细胞却无明显的毒副作用。 本文的目的是通过对抗菌肽一级结构和二级结构的分析,以Cecropin B基因序列为蓝本,根据植物偏爱的密码子设计了一种新型的抗菌肽Cecropin B基因序列,通过重叠区扩增法人工合成了这种新型Cecropin B基因,然后将其连接至在巴斯德毕赤酵母中高效表达的pPIC9K载体上,分泌表达获得这种新型抗菌肽。测定其抑菌活性。最终目的是将这种具有活性的新型的抗菌肽Cecropin B基因导入农作物中,以期获得抗软腐病（E.carotovora）又抗烟草青枯病（Pseudomonas solanacearum pv tabaci）的转基因植物,这两种疾病是在我国农作物中普遍流行的疾病。

论文目录

• 第一部分 抗菌肽研究进展
• 1. 抗菌肽
• 1.1 抗菌肽的发现
• 1.2 抗菌肽的结构特点、分类及理化性质
• 1.3 抗菌肽的作用机理研究进展
• 1.4 抗菌肽的生物功能及药理作用
• 1.5 抗菌肽的应用前景
• 1.6 抗菌肽的来源
• 1.7 抗菌肽分子生物学研究进展
• 2. 抗菌肽基因工程
• 3. 抗菌肽转基因研究
• 4. 该课题实验的意义和研究内容
• 第二部分 材料和方法
• 1. 主要试剂与仪器
• 1.1 基本试剂及生产厂家
• 1.2 酶和其他试剂
• 1.3 本试验所用的菌株及质粒
• 1.4 主要仪器和厂家
• 1.5 试剂和培养基
• 1.5.1 试剂
• 1.5.2 培养基
• 1.5.3 抗生素
• 2. 实验方法
• 2.1 抗菌肽cecropin B的基因序列设计
• 2.2 抗菌肽cecropin B的序列合成
• 2.2.1 部分片段的设计和合成
• 2.2.2 CB全序列的人工合成实验步骤
• 2.3 CB的PCR产物纯化
• 2.4 测序载体pUC19的制备
• 2.5 目的CB片段和测序载体限制性酶切反应
• 2.5.1 DNA限制性内切酶酶切反应
• 2.5.2 测序载体pUC19的限制性内切酶酶切反应
• 2.6 CB-DNA酶切片段与pUC19酶切片段的酶连
• 2.7 测序载体的转化扩增
• 2.7.1 大肠杆菌JM109感受态的制备
• 2.7.2 pUC19-CB转化大肠杆菌JM109的感受态细胞
• 2.7.3 pUC19-CB质粒 DNA的筛选
• 2.8 目的片段CB与表达载体pPIC9K的连接及转化
• 2.8.1 酶切
• 2.8.2 酶连
• 2.8.3 转化和筛选
• 2.9 酵母的转导
• 2.9.1 Pichia pastoris SMD1168感受态细胞的准备
• 2.9.2 电激转化
• 2.9.3 阳性克隆的筛选
• 2.9.4 重组酵母的诱导表达试验
• 第三部分 结果与分析
• 1. CB的合成
• 1.1 片段1与片段 2PCR结果和片段3与片段4的PCR结果
• 1.2 CB全长的PCR结果
• 2. CB-DNA酶切片段与pUC19酶切片段的酶连结果的 PCR鉴定
• 3. pUC19载体中 CB片段全长的测序结果
• 4. 酵母的转化及筛选
• 4.1 重组型质粒转化酵母细胞
• 4.2 重组酵母株的PCR鉴定
• 5. 表达产物抗菌肽抗菌活性的测定结果
• 5.1 新型抗菌肽对软腐病菌 E．carotovora的抑菌结果
• 5.2 新型抗菌肽对烟草青枯病菌Pseudomonas solanaceaom pv tabaci的抑菌结果
• 第四部分 讨论
• 1. 新型抗菌肽基因的设计创新
• 1.1 新型抗菌肽基因与天蚕素抗菌肽 Cecropin B基因的同源性对比
• 1.2 抗菌效果
• 1.3 应用前景
• 2. 表达系统
• 2.1 Pichia．pasteoris 基因表达系统研究进展
• 2.2 表达载体的构成
• 2.3 表达载体与宿主染色体的整合
• 2.4 影响外源基因表达量的因素
• 2.5 本次实验表达酵母-Pichia．pasteoris SMD1168的特点
• 2.6 表达载体pPIC9K的特点
• 3. 本次实验的不足
• 4. 下一步打算
• 第五部分 结论
• 第六部分 参考文献
• 致谢