水貂肠炎细小病毒NS1基因的真核表达与生物学特性分析

论文摘要

水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis virus, MEV)属于细小病毒科,细小病毒属,为猫泛白细胞减少症病毒亚群。病毒基因组为单股、负链DNA病毒,自然条件下,病毒引起水貂的病毒性肠炎,以剧烈腹泻为临床特征,幼龄水貂具有较强易感性。目前,MEV引起的水貂病毒性肠炎仍流行严重,阻碍毛皮动物养殖业的发展,特别是给水貂养殖业带来巨大的经济损失。细小病毒NS1蛋白在病毒的复制和转录过程中具有重要作用。通过分离水貂肠炎细小病毒、犬细小病毒毒株,PCR扩增其非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2全基因编码序列,并同GenBank核酸数据库中的其他细小病毒进行序列比对,归纳总结细小病毒间非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2间的氨基酸差异位点,并对细小病毒NS1蛋白的磷酸化位点进行预测,构建遗传发育进化树,分析水貂肠炎细小病毒同其他细小病毒之间重要氨基酸位点的差异及其遗传进化关系。水貂肠炎细小病毒氨基酸遗传变异规律的分析,对深入了解病毒的遗传变异情况、变异规律、病毒的跨种间传播机制以及更好的预防和控制水貂肠炎细小病毒病具有重要的意义。PCR扩增水貂肠炎细小病毒MEVB株NS1蛋白全基因序列,利用Bac to Bac蛋白表达系统,获得表达NS1蛋白的重组杆状病毒,进一步表达纯化获得MEV的非结构蛋白NS1。经PCR鉴定转染成功后,采用间接免疫荧光、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot鉴定证实了重组蛋白的表达且重组NS1蛋白具有良好的抗原特异性。对表达纯化的NS1蛋白进行生物学特性分析发现,其等电点和空间构象均与自然条件下病毒感染表达的NS1蛋白相似。利用表达纯化的NS1蛋白做为包被抗原,间接ELISA方法检测MEV病毒免疫小鼠后NS1蛋白抗体水平,并与MEV抗体水平对比。研究发现,MEV病毒感染过程中,NS1蛋白抗体检测OD值在第4天开始升高,第8天之后开始下降并持续至感染后12 d;而MEV抗体检测在12 d后开始下降;而灭活病毒免疫小鼠后抗体检测发现,免疫动物体内几乎检测不到针对NS1蛋白的抗体。灭活疫苗免疫水貂71份血清样本NS1蛋白抗体检测发现,免疫水貂体内具有MEV抗体,但并无NS1蛋白抗体。表达纯化的NS1蛋白为建立鉴别诊断病毒感染与疫苗免疫动物的方法提供物质基础,同时监测非结构蛋白和病毒抗体水平为防控水貂病毒性肠炎提供科学依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 食肉动物细小病毒简介
• 1.1.1 猫泛白细胞减少症病毒
• 1.1.2 犬细小病毒
• 1.1.3 水貂肠炎细小病毒
• 1.2 食肉动物细小病毒特性
• 1.2.1 分子生物学特性
• 1.2.2 病毒的复制机制
• 1.2.3 理化与增殖特性
• 1.2.4 抗原特性
• 1.2.5 病毒跨种间传播的特点
• 1.3 水貂肠炎细小病毒研究进展
• 1.3.1 水貂肠炎细小病毒简介
• 1.3.2 水貂肠炎细小病毒病原学
• 1.3.3 水貂肠炎细小病毒的分子生物学特性
• 1.3.4 水貂肠炎细小病毒编码蛋白
• 1.3.4.1 结构蛋白
• 1.3.4.2 非结构蛋白
• 1.3.5 水貂肠炎细小病毒致病机理
• 1.3.6 水貂肠炎细小病毒的免疫预防
• 1.4 本研究的背景与目的
• 第二章 水貂肠炎细小病毒NS1 蛋白基因序列分析及系统发育树的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株
• 2.1.2 主要仪器、试剂、菌株和载体
• 2.2 方法
• 2.2.1 病料处理
• 2.2.2 病毒基因组的提取
• 2.2.3 引物的设计与合成
• 2.2.4 NS1 和VP2 全基因扩增
• 2.2.5 扩增产物的克隆
• 2.2.5.1 PCR 扩增片段与PMD18-T 载体连接
• 2.2.5.2 连接产物转化DH5α感受态细胞
• 2.2.6 重组阳性质粒筛选
• 2.2.7 NS1 基因遗传变异分析
• 2.2.7.1 NS1 基因同源性分析
• 2.2.7.2 NS1 蛋白磷酸化位点预测分析
• 2.2.7.3 NS1 蛋白重要氨基酸差异位点对比分析
• 2.2.7.4 NS1 全基因推导氨基酸序列系统发育树的构建
• 2.2.8 VP2 基因遗传变异分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 犬细小病毒、水貂肠炎细小病毒NS1 和VP2 全基因PCR 扩增结果
• 2.3.2 重组质粒双酶切鉴定结果
• 2.3.3 FPLV、CPV 和MEV 不同病毒株NS1 基因以及氨基酸序列分析
• 2.3.3.1 NS1 基因同源性分析
• 2.3.3.2 NS1 蛋白磷酸化位点预测分析
• 2.3.3.3 NS1 基因推导的氨基酸差异分析
• 2.3.3.4 NS1 基因推到的氨基酸序列系统进化树分析
• 2.3.4 FPLV、CPV 和MEV 不同病毒株VP2 基因及氨基酸序列分析
• 2.3.4.1 VP2 基因同源性分析
• 2.3.4.2 VP2 基因推导的氨基酸差异分析
• 2.3.4.3 VP2 基因推导的氨基酸序列系统进化树分析
• 2.4 讨论
• 第三章 Bac to Bac 系统表达与纯化MEV 非结构蛋白NS1
• 3.1 材料
• 3.1.1 病毒与细胞系
• 3.1.2 主要仪器与试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 水貂肠炎细小病毒MEVB 株DNA 的提取
• 3.2.2 NS1 基因的扩增
• 3.2.3 NS1 基因序列的克隆
• 3.2.3.1 NS1 基因与PCR-Blunt 载体连接
• 3.2.3.2 Blunt 载体连接产物转化DH5α感受态细胞
• 3.2.4 重组Blunt-NS1 质粒的鉴定
• 3.2.5 NS1 蛋白真核表达穿梭载体的构建
• 3.2.5.1 粘性末端NS1 基因的制备
• 3.2.5.2 粘性末端pFastBacHTA 载体的制备
• 3.2.5.3 粘性NS1 基因片段与pFastBac HTA 空载体连接
• 3.2.5.4 连接产物的转化DH5α感受态细胞
• 3.2.5.5 重组pFastbacHTA-NS1 鉴定
• 3.2.5.5.1 PCR 鉴定
• 3.3.5.5.2 pFastBacHTA-NS1 阳性质粒的单双酶切鉴定
• 3.2.6 重组NS1 Bacmid 杆粒的构建
• 3.2.6.1 重组穿梭载体转化 DH10Bac 感受态细胞
• 3.2.6.2 重组NS1 Bacmid 杆粒的鉴定与提取
• 3.2.7 重组NS1 蛋白在sf9 昆虫细胞中的表达
• 3.2.7.1 重组NS1 杆粒转染sf9 昆虫细胞
• 3.2.7.2 重组杆状病毒贮液的制备
• 3.2.7.3 重组杆状病毒PCR 鉴定
• 3.2.7.4 重组杆状病毒滴度检测
• 3.2.8 重组NS1 蛋白（rNS1）表达与鉴定
• 3.2.8.1 重组NS1 蛋白（rNS1）表达
• 3.2.8.2 重组NS1 蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定
• 3.2.8.3 间接免疫荧光试验（IFA）鉴定
• 3.2.8.4 Western blot 鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 NS1 全基因序列的扩增
• 3.3.2 pFastBacHTA-NS1 重组质粒单双酶切鉴定
• 3.3.3 重组NS1 Bacmid 杆粒PCR 鉴定
• 3.3.4 细胞病变
• 3.3.5 重组杆状病毒PCR 鉴定
• 3.3.6 重组杆状病毒滴度测定
• 3.3.7 重组NS1 蛋白表达分析
• 3.3.8 间接免疫荧光试验鉴定分析
• 3.3.9 重组 NS1 蛋白 western bolt 鉴定分析
• 3.4 讨论
• 第四章 重组非结构蛋白NS1 生物学特性分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 病毒、细胞与实验动物
• 4.1.2 主要试剂、仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 重组NS1 蛋白等电点与构象分析
• 4.2.2 重组NS1 蛋白细胞毒性分析
• 4.2.2.1 细胞处理
• 4.2.2.2 蛋白浓度测定
• 4.2.2.3 细胞毒性分析
• 4.2.3 小鼠体内MEV 非结构蛋白抗体水平检测
• 4.2.3.1 活病毒免疫小鼠体内MEV 抗体水平检测
• 4.2.3.2 灭活病毒免疫小鼠体内MEV 抗体水平检测
• 4.2.3.3 活病毒、灭活病毒免疫小鼠体内NS1 蛋白 IgG 抗体水平检测
• 4.2.4 水貂血清样本NS1 蛋白抗体检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组NS1 蛋白等电点预测
• 4.3.2 重组NS1 蛋白构象预测
• 4.3.3 重组NS1 蛋白细胞毒性鉴定
• 4.3.4 MEV 活病毒免疫小鼠体内MEV 抗体检测
• 4.3.5 MEV 灭活病毒免疫小鼠体内MEV 抗体检测
• 4.3.6 MEV 活病毒免疫小鼠体内 NS1 蛋白抗体水平检测
• 4.3.7 MEV 灭活病毒免疫小鼠后 NS1 蛋白抗体水平检测
• 4.3.8 水貂血清样本 NS1 蛋白抗体检测
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历