论文摘要
吗啡作为阿片类药物的代表,至今仍在缓解中、重度疼痛中占有重要地位,但由于长期应用可导致耐受和成瘾,影响了其在临床中的应用。近年来,针对吗啡耐受机制进行了多方面的研究,建立了在体和体外吗啡耐受模型,并在细胞信号转导方面对吗啡耐受机制的研究取得了一些进展,但由于吗啡耐受机制极其复杂,体外模型获得的结论还难以解释在体模型的一些现象,很多研究尚未得到确切结论,有些结果仍互相矛盾,因此有必要对在体吗啡耐受模型有关受体和基因表达及其调控机制进行深入研究。本研究拟立足于吗啡发挥作用的首要环节—阿片受体来研究吗啡耐受的机制,采用经典吗啡耐受模型、免疫组织化学分析以及荧光定量PCR方法测定μ、δ、κ三种阿片受体在大鼠神经系统的表达,以探讨吗啡耐受情况下三种阿片受体发生变化的主要部位和相互关系,力图为进一步揭示吗啡耐受机制提供实验依据。第一部分吗啡耐受模型的建立选取基础痛阈相近的健康成年雄性Wistar大鼠32只,采用随机数字表将大鼠随机平均分为两组:生理盐水组(NS组,n=16)和硫酸吗啡组(MS组,n=16)。两组大鼠混笼饲养,采用盲法进行给药和痛行为测定。以大鼠热水浴甩尾潜伏期(Tail FlickLateny,TFL)作为痛阈标准。每天两次皮下注射药物(8:00和16:00)并于上午注射前、后30min测定TFL。NS组皮下注射生理盐水1mL/kg,MS组皮下注射吗啡10mg/kg,连续注射7天,第8天早晨各组分别取8只处死,剩余大鼠(分别记为NSN组和MSN组)第8天早晚两次皮下注射纳洛酮0.4mg/kg,第9天亦处死。为了防止烫伤大鼠尾部皮肤,当TFL达到12s时,终止测试并将甩尾潜伏期数值记为12s。观察各组大鼠痛阈变化,以TFL恢复至基础水平作为出现耐受性的标准。结果显示:两组大鼠在观察期体重逐日增加,组间比较体重的增加量无显著性差异。每日注射前测定的痛阈在组间和组内比较无显著性差异,随着吗啡使用次数的增加,MS组用药前痛阈并未发生显著性变化(P＞0.05);MS组在第一天皮下注射吗啡后,痛阈较NS组和基础值明显升高(P＜0.05);随着吗啡用药次数增加,该组大鼠用药后的痛阈逐渐下降,直至第7天用药后痛阈降至基础水平,第9天应用纳络酮后的痛阈与NS组和基础值相比,没有显著性变化。第二部分吗啡耐受大鼠神经系统阿片受体的蛋白表达选取基础痛阈相近的健康成年雄性Wistar大鼠16只,随机平均分为两组:生理盐水组(NS组,n=8)和硫酸吗啡组(MS组,n=8)。给药方法、痛阈测定方法及吗啡耐受判断标准同第一部分,连续注射7天,第8天早晨各组分别取4只处死,剩余大鼠(分别记为NSN组和MSN组)第8天早晚两次皮下注射纳洛酮0.4mg/kg,第9天亦处死。所有大鼠于深麻醉下经灌流固定处死后,取出脑和脊髓组织制作石蜡切片,进行免疫组织化学染色,分析丘脑、下丘脑、蓝斑、海马、中脑导水管周围灰质(PAG)和腰骶段脊髓Ⅰ—Ⅴ板层μ、δ、κ阿片受体的蛋白表达情况。结果显示:吗啡耐受大鼠PAG区域的μ受体和δ受体的蛋白表达明显低于对照组,δ受体在蓝斑区域的表达亦显著低于对照组;κ受体在蓝斑和脊髓背角的表达却显著升高。第三部分吗啡耐受大鼠中枢神经系统阿片受体的mRNA表达选取基础痛阈相近的健康成年雄性Wistar大鼠16只,随机平均分为两组:生理盐水组(NS组,n=8)和硫酸吗啡组(MS组,n=8)。给药方法、痛阈测定方法及吗啡耐受判断标准同第一部分,连续注射7天,第8天早晨各组分别取4只处死,剩余大鼠(分别记为NSN组和MSN组)第8天早晚两次皮下注射纳洛酮0.4mg/kg,第9天亦处死。所有大鼠于深麻醉下断头处死,迅速取出丘脑、下丘脑、蓝斑、海马、PAG、腰骶段脊髓以及背根神经节(DRG),分别提取组织总RNA,并采用荧光定量PCR(real timePCR)方法测定各部位μ、δ、κ阿片受体的mRNA表达情况。结果显示:吗啡耐受大鼠PAG区域的μ受体和δ受体的mRNA表达明显低于对照组,δ受体在蓝斑区域的mRNA表达亦显著低于对照组;κ受体在蓝斑和脊髓背角的mRNA表达均显著升高,但在背根神经节的表达却显著降低。通过本研究,我们得出以下结论:1.吗啡耐受可能是多个阿片受体共同作用的结果;2.吗啡耐受大鼠PAG区域的μ受体呈下调表现;3.吗啡耐受大鼠蓝斑和PAG区域的δ受体呈下调表现;4.吗啡耐受大鼠蓝斑和脊髓背角κ受体呈上调表现,但脊髓背根神经节κ受体明显下调;5.与吗啡耐受相关的部位涉及PAG、蓝斑、脊髓背角以及脊髓背根神经节。