论文摘要
乌桕（Sapium sebiferum）是一种重要的油料树种和园林观赏植物,栽培和利用的历史非常悠久。乌桕也是一种非常有潜力的生物能源植物,成年植株每年生产大量的种子,含油量达到45%以上,种子油可以用于生产生物柴油；同时,乌桕对土壤和气候适应性广,生长速度快,每年形成大量的生物量,可用于燃烧发电和作为生产乙醇、甲醇或炭的原料。目前,生产上栽培利用的都是二倍体乌桕,三倍体乌桕还没有见报道。本研究以乌桕成熟种子的胚乳为外植体,通过研究不同植物激素组合对愈伤组织和不定芽诱导、幼茎伸长和生根的影响,建立了一套有效的培育乌桕三倍体的方法；在此基础上,进一步研究了乌桕胚乳转基因的方法。结果表明：（1）在添加有1-5mg/L BA和0.2mg/L NAA的MS培养基上培养30天,70%的乌桕成熟胚乳可以形成绿色、结实的愈伤组织。（2）将愈伤组织且成小块后,接种到添加有,1.0-2.0mg/LBA和0或0.1mg/L NAA的MS培养基上培养45天,大约60%的愈伤组织可以形成2-5个不定芽。（3）将不定芽转到添加有0.1mg/LBA和1g/L活性炭的MS培养基上,42%的不定芽可以伸长、形成幼茎。（4）将幼茎培养在2.0mg/L IBA和1g/L活性炭的MS培养基上,30天后均全部生根、形成完整的植株。（5）以种子萌发的二倍体幼苗为对照,利用流式细胞仪对部分胚乳再生的植株进行倍性测定,证明均为三倍体植株。三倍体植株移载后,生长正常,形态上与二倍体无明显差别。（6）2mm厚的乌桕胚乳愈伤组织薄片对卡那霉素较敏感,其临界浓度为50mg/L。（7）将乌桕胚乳愈伤组织薄片在农杆菌菌液中浸染30分钟后,转入含有100gM乙酰丁香酮、2mg/L BA和0.5mg/L NAA的MS培养基上的共培养2天,然后在含2mg/L BA、0.5mg/L NAA、50mg/L卡那霉素和100mg/L Timentin的MS培养基上进行筛选培养三个月,得了9个独立的GUS染色阳性愈伤组织,进一步用PCR检测,证明外源基因插入到愈伤组织细胞的基因组中。
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摘要ABSTRACT第一部分 绪论1.1 乌桕的生物学简介1.2 乌桕的经济价值1.2.1 油料植物1.2.2 园林观赏植物1.2.3 药用植物1.2.4 生物质能源植物1.3 乌桕的繁殖1.3.1 种子繁殖1.3.2 扦插与嫁接1.3.3 乌桕品种资源的调查及优种选育1.4 乌桕组织培养技术1.5 三倍体植物的特性与三倍体育种1.5.1 三倍体的特性1.5.2 三倍体的选育途径1.6 流式细胞术1.7 植物转基因1.7.1 植物转基因的方法1.7.2 植物转基因技术的应用1.8 本研究的目的和意义第二部分 乌桕胚乳培养与三倍体植株再生体系的建立2.1 材料2.1.1 实验材料2.1.2 培养基和培养条件2.1.3 本实验所用试剂及缓冲液2.2 方法2.2.1 胚乳愈伤组织的诱导2.2.2 不定芽的诱导2.2.3 不定芽的伸长2.2.4 幼茎的生根2.2.5 再生植株的倍性鉴定2.3 结果与分析2.3.1 乌桕胚乳愈伤组织的诱导2.3.2 不定芽的诱导2.3.3 不定芽的伸长2.3.4 小苗的生根与移栽2.3.5 倍性鉴定第三部分：乌桕胚乳转基因及鉴定3.1 材料与方法3.1.1 实验材料3.1.2 培养基与培养条件3.1.3 本实验所用试剂及缓冲液3.1.4 植物培养用培养基3.1.5 细菌用培养基3.2 实验方法3.2.1 质粒DNA的抽提及纯化3.2.2 根癌农杆菌EHA-105感受态细胞的制备3.2.3 农杆菌的转化3.2.4 CTAB法快速抽提基因组DNA3.3 胚乳愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验3.4 农杆菌介导的乌桕胚乳转基因3.4.1 表达载体与农杆菌菌株3.4.2 农杆菌菌液的准备3.4.3 乌桕胚乳愈伤组织的准备3.4.4 感染3.4.5 菌液浓度、乙酰丁香酮浓度对乌桕胚乳转基因的影响3.4.6 共培养3.4.7 转基因植物的选择与再生3.5 转基因愈伤组织的鉴定3.5.1 GUS组织化学染色3.5.2 PCR检测3.6 结果与分析3.6.1 胚乳愈伤组织的卡那霉素敏感性3.6.2 菌液浓度、乙酰丁香酮浓度对乌桕胚乳转基因的影响3.6.3 GUS组织化学染色3.6.4 PCR鉴定转基因植株第四部分 讨论与展望4.1 胚乳培养4.2 倍性鉴定4.3 三倍体的特征4.4 影响农杆菌转化效率的因素4.5 转基因的后期鉴定参考文献致谢
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