论文摘要
背景与目的恶性肿瘤是威胁人类最严重的疾病之一，治疗恶性肿瘤的方法主要有外科（手术切除）、化疗、放疗，后来又出现了生物治疗。病毒治疗也属于生物治疗方法，近20年来发展非常迅速，临床试验的结果也令人鼓舞，为肿瘤的治疗开辟了新的路径。我们构建了一个新型溶瘤腺病毒SG235，此病毒以5型腺病毒为骨架，35型病毒的shaft、knob和5型的trail构成病毒的fiber，E1B55KD区缺失的嵌合型病毒，此病毒克服了以前需要依赖肿瘤细胞表面CAR高表达的局限性，特异性的针对P53缺失或者突变的肿瘤细胞，而对有P53功能的正常细胞没有影响。病毒在肿瘤细胞内复制、增殖，并且激活凋亡通路，引起肿瘤细胞死亡，释放子代病毒继续感染周围的病毒，而达到杀灭所有肿瘤细胞的目的。方法1、利用携带有能表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体SG235—EGFP（enhance Green fluorescent protein），体外感染血液肿瘤细胞MUTZ-1、Kasumi、K562、HL-60、Molt-4、RPMI8226、L428、Jurkat，利用流式细胞仪和荧光显微镜观察感染效果。2、利用流式细胞术定量检测GFP在SG235—EGFP感染后的不同血液肿瘤细胞中的的表达量。3、应用MTT法，检测SG235对血液肿瘤细胞株增殖的影响。4、利用Annexin V／PI双染及TUNEL检测细胞凋亡。5、SG235感染MUTZ-1，电镜下观察凋亡细胞。6、Western Blot检测SG235感染血液肿瘤细胞后凋亡相关蛋白PARP、caspase-3、caspase-9、Bcl-2、p—AKT蛋白的表达。7、SG235分别瘤内注射MUTZ-1、Kasumi荷瘤小鼠，观察SG235病毒体内的抗瘤能力。8、SG235感染造血干细胞，观察病毒对正常造血组织的影响。结果不同感染复数MOI（Multiplicity of Infection，MOI）SG235—EGFP体外感染血液肿瘤细胞MUTZ-1、Kasumi、K562、HL60、Molt-4、RPMI8226、L428、Jurkat 48小时后利用流式细胞仪检测细胞内GFP蛋白表达，发现GFP在不同血液肿瘤中均有表达。荧光显微镜结果显示，5、25、50 MOI的SG235—EGFP感染MUTZ-1、Kasumi细胞株24、48小时后，能够表现不同强度的荧光，随着感染复数的增高和时间的延长，荧光强度相应增强。MTT法检测了SG235对MUTZ-1、Kasumi细胞生长的影响，发现SG235显著抑制MUTZ-1、Kasumi细胞的生长，抑制作用呈剂量及时间依赖方式。我们进一步采用电镜、TUNEL及流式细胞仪检测了MUTZ-1和Kasumi细胞的凋亡，结果显示SG235感染MUTZ-1 48小时后可以出现染色质凝聚，而流式细胞仪检测结果显示SG235感染MUTZ-1、Kasumi细胞48h后，随着感染复数的增加，细胞凋亡率也增加。为进一步阐明SG235启动MUTZ-1细胞凋亡的通路，我们采用Western Blot法检测caspase9及3蛋白的表达，发现50 MOISG235作用MUTZ-1细胞24h、48h可出现caspase3和caspase9大小分别为19kDa及37kDa的活性条带，进一步检测caspase 3的作用底物PARP蛋白，同样可检测到其大小为89kDa的活性片段，说明caspase9、3及PARP的激活是SG235诱导MUTZ-1细胞凋亡的重要途径。我们用SG235感染染造血干细胞，发现病毒对造血干细胞形成集落能力没有改变。SG235瘤内注射MUTZ-1、Kasumi荷瘤小鼠，显示SG235病毒在体内具有抗瘤能力，可以缩小瘤体体积，延长荷瘤小鼠寿命。结论1、溶癌腺病毒SG235能在体外成功感染血液肿瘤细胞MUTZ-1、Kasumi、K562、HL-60、Molt-4、RPMI8226、L428、Jurkat，并具有较高的感染效率。2、溶癌腺病毒SG235对MUTZ-1、Kasumi细胞具有明显的生长抑制作用，且具有时间—剂量依赖关系。3、溶癌腺病毒SG235不影响正常造血干细胞集落形成。4、溶癌腺病毒SG235通过激活caspase9、3及PARP诱导MUTZ-1细胞凋亡。5．溶癌腺病毒SG235在SCID小鼠体内具有明显的抑制肿瘤生长和延长小鼠生存时间的作用。6、SG235载体在血液肿瘤细胞中的复制具有肿瘤特异性，这可能跟血液肿瘤细胞p53功能缺失相关。7、SG235具有的肿瘤特异性复制能力，使其能够在肿瘤的基因治疗中安全、高效的使用，具有极大的临床应用前景。