鸵鸟隐孢子虫分子生物学特性及隐孢子虫对禽类宿主适应性遗传学分析

论文摘要

本试验对河南省鸵鸟隐孢子虫、鸭隐孢子虫进行流行病学调查,共获得14个鸵鸟源隐孢子虫分离株,96个鸭源隐孢子虫分离株;应用巢式PCR检测和聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（Polymerase Chain Reaction Linked Restriction Fragment Length Polymorphism , PCR-RFLP）分析;基于核糖体小亚基（18S rRNA）基因、70kD热休克蛋白（HSP70）基因、肌动蛋白（Actin）基因的种类与基因型分析,鉴定河南地区鸵鸟源隐孢子虫分离株种类、基因型和基因亚型,确定本地区鸵鸟源隐孢子虫分离株和其它种类隐孢子虫之间的分子种系进化关系,推断鸵鸟源隐孢子虫病的感染来源和传播机制,为预防鸵鸟隐孢子虫病提供理论基础;同时针对不同禽源的隐孢子虫分离株进行种系发育分析,研究隐孢子虫对禽类宿主适应性的遗传差异,多位点分析研究表明宿主适应性是隐孢子虫普遍现象,不同地理区域、不同种类的禽类感染C. baileyi序列没有显著差异。1、为了系统掌握河南地区鸵鸟隐孢子虫流行状况,于2006年8月～2007年8月对河南地区6个养殖场共829份样品应用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法进行感染情况调查,结果显示隐孢子虫总感染率为1.7%（14/829）,其中,郑州某驼鸟场的感染率2.8%（14/506）,其它养殖场未发现隐孢子虫感染。所查到的14份隐孢子虫阳性样品来自20～40 d鸵鸟,表明幼龄鸵鸟更容易感染隐孢子虫。鸵鸟隐孢子虫卵囊大小为4.2～6.0μm×4.5～5.0μm,平均5.56μm×4.48μm,卵囊形状指数（L/W ）为1.24（n=100）,根据卵囊形态结构特征初步鉴定为贝氏隐孢子虫（Cryptosporidium baileyi）。2、2006年10月～2007年5月,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检查了河南地区8个鸭场共564份粪便样品,隐孢子虫阳性率为16.31%（92/564）,其中,4个鸭场检查到隐孢子虫卵囊,感染率分别为100.00%、73.33%、51.79%、41.46%。在所查到的92份阳性样品中,感染隐孢子虫的雏鸭日龄均在50 d以下,表明雏鸭对隐孢子虫更易感,并且不同日龄感染率存在着明显差异。本次调查所分离卵囊的大小为5.82μm×4.40μm;卵囊形状指数（L/W ） 1.32（n=100）,根据卵囊形态结构特征初步鉴定为（C. baileyi）。3、利用巢式PCR扩增9个鸵鸟源隐孢子虫分离株18S rRNA基因部分片段,对PCR产物进行测序,序列长度均为820bp左右;用限制性内切酶SspI和VspI对PCR产物进行消化酶切确定种类和基因型。PCR-RFLP方法分析鉴定9个鸵鸟源隐孢子虫分离株,经SspI酶酶切后产生260bp、570bp两个片段;VspI酶酶切后产生100～110bp、620bp两个片段。根据酶切片段初步确定这9个鸵鸟源隐孢子虫分离株为贝氏隐孢子虫（C. baileyi）。4、为了从种系发育关系确定河南地区鸵鸟源隐孢分离株的种类或基因型,利用巢式PCR对9个隐孢子虫分离株进行18S rRNA基因、HSP70基因、Actin基因特定片段扩增、测序,测序后的序列用Blast在NCBI、EMBL和DDBJ三大核酸序列数据库搜索同源序列,然后利用Clustal X1.81、Phylip3.65和DNAStar4.0等生物学软件对序列进行比对、构建分子进化树以及同源性分析。根据在18S rRNA基因位点、HSP70基因位点、Actin基因位点种系进化关系分析,表明鸵鸟源隐孢子虫分离株为C. baileyi。5、利用巢式PCR对鸡源、鸭源、鸽源、鹌鹑源隐孢子虫分离株进行18S rRNA基因、HSP70基因、Actin基因扩增,并对扩增片段进行测序,测序后的序列用Blast在NCBI、EMBL和DDBJ三大核酸序列数据库搜索同源序列,然后利用Clustal X1.81、Phylip3.65和DNAStar4.0等生物学软件对序列进行比对、构建分子进化树以及同源性分析,探讨隐孢子虫对禽类宿主适应性的遗传特性,根据三个基因位点种系进化关系分析隐孢子虫对禽类宿主适应性的遗传差异。基于PCR-RFLP分析和18S rRNA基因、HSP70基因、Actin基因多位点的种系发育分析,确定本次试验获得的鸵鸟源隐孢子虫分离株为C. baileyi,河南地区鸵鸟隐孢子虫优势种为C. baileyi,为以后鸵鸟隐孢子虫病的分子流行病学研究提供了分子生物学背景和重要理论基础。三个基因位点分析鸵鸟源隐孢子虫、鸭源隐孢子虫、北京鸡源隐孢子虫、宁夏鸡源隐孢子虫、鹌鹑源隐孢子虫、丝毛乌鸡源隐孢子虫等不同禽源分离株, C. baileyi隐孢子虫没有严格的宿主特异性,能感染多种禽类;不同地理区域、不同来源的C. baileyi序列没有差异。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 综述：基因分型工具研究进展
• 第一部分 河南地区鸵鸟隐孢子虫病流行病学调查
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第二部分 河南地区鸭隐孢子虫病流行病学调查
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第三部分 鸵鸟源隐孢子虫分离株巢式PCR-RFLP 鉴定
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第四部分 基于1851 RNA 基因、HSP70 基因、Actin 基因的鸵鸟源隐孢子虫种系发育关系研究
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第五部分 禽类隐孢子虫宿主适应性的遗传学分析
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 参考文献
• Abstract
• 硕士期间发表的文章