尖吻蝮蛇血凝酶药效评价及其作用机制的研究

论文摘要

研究背景和目的尖吻蝮蛇血凝酶（Haemocoagulase Agkistrodon, HCA）是一种从尖吻蝮蛇毒液中提取分离出来的蛇毒类血凝酶。目前研究表明,该类血凝酶具有良好的止血作用,而且不良反应轻,耐受性好。作为一种新型高效低毒的止血药物,在临床上可用于某些出血性疾病,如创伤、手术引起的出血,消化道、呼吸道出血,妇科出血等。康辰医药股份有限公司于2009年3月份将其作为国家一类创新药物申报上市销售,商品名“苏灵”。它是利用我国特有的蛇种——尖吻蝮蛇体内的毒液研制而出的新一代临床止血药,采用全球领先的蛇毒单体提纯技术,使单一组分纯度达到99%,是迄今为止我国上市产品中唯一完成全部氨基酸测序的单一组分的蛇毒血凝酶类药物。HCA在不激活凝血因子ⅩⅢ（Coagulation FactorⅩⅢ, FⅩⅢ）的情况下,在血管内作用产生较高浓度的可溶性纤维蛋白,从而使伤口部位加速止血。而在正常的血管内,则不会造成血栓形成。因此可以说,苏灵是一个优良的体内外止血药物。HCA作为一个新研发的临床止血药,其药效以及作用机制已经有了一个初步的认识。但是与其他临床上使用的同类产品相比,其疗效到底如何、其体内作用机制到底是怎样的,还需要作进一步的研究。本实验从HCA体内外的凝血效果、对人体血液中各个凝血因子的作用特点着手,试图全面认识HCA的疗效和作用机制,从而为苏灵的临床应用提供实验依据,确保其用药安全。方法1 HCA体外药效评价部分1.1 HCA对体外凝块形成的最适浓度研究取4单位HCA,用注射用水溶解配制成不同浓度的HCA溶液,与标准人血浆混合,混匀后于37℃水浴锅中孵育,观察凝固过程,待凝块形成30min后,称量并记录血凝块情况。1.2含凝血因子ⅩⅢ药效实验分别取尖吻蝮蛇血凝酶、立止血、凝血酶与标准人血浆混合,混匀后于37℃水浴锅中孵育,待凝块形成30min后,将凝块取出,用滤纸吸干其水分后称重,评价各试验药物的效果。1.3不含凝血因子ⅩⅢ药效实验另用尖吻蝮蛇凝血酶、立止血、凝血酶和人纤维蛋白原溶液混合,混匀后于37℃水浴锅中孵育,待凝块形成30min后,将凝块取出,用滤纸吸干其水分后称重,评价各实验药物的效果。2 HCA体内药效评价部分2.1小鼠剪尾出血时间测定实验昆明小鼠静脉注射各实验药物,给药30分钟后,在鼠尾尖向上约0.5cm处快速剪断尾部,同时按动秒表记时,用滤纸片吸取流出的血液,记录出血时间,通过出血时间的长短来评价各实验药物的效果。2.2大鼠体内血栓实验SD大鼠静脉注射各实验药物,给药后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,仰卧固定于手术台,于腹中线纵向切开皮肤约3cm,从腹白线处打开腹腔,钝性分离下腔静脉,于左肾静脉下方用4号缝合线结扎下腔静脉,同时结扎下方两条主要分支静脉,缝合腹壁,3h后重新打开腹腔,在结扎处下方约2cm处用4号缝合线结扎,将该段管腔内血液吸尽,纵行剪开,观察有无血栓形成,如有则取出血栓称湿重,通过血栓大小来评价各实验药物的效果。3作用机制部分3.1 HCA对凝血因子Ⅰ（Coagulation FactorⅠ, FⅠ）的作用3.1.1高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）分析HCA释放纤维蛋白肽的作用将4U/mlHCA溶液、4U/ml立止血溶液、8U/ml人凝血酶溶液分别与纤维蛋白原溶液混匀后在37℃条件下充分孵育。取每个体系中孵育凝固后的产物,100℃沸水中煮5min,产物13000rpm离心M0min,取上清液进行高效液相色谱分析。3.1.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析HCA裂解纤维蛋白肽的作用将4U/mlHCA与纤维蛋白原溶液混匀后在37℃条件下分别水浴10min、30min、1h、2h、4h和12h。水浴结束后向每个反应体系中加入5mol/L尿素溶液0.5ml使纤维蛋白凝块溶解,然后将溶解后的样品与SDS-PAGE上样缓冲液4：1混合,沸水煮3-5min,取15μl小心上样,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。3.2 HCA对凝血因子ⅩⅢ（Coagulation FactorⅩⅢ, FⅩⅢ）的作用3.2.1体外凝块溶解性研究分别取0.5ml已在37℃预热的1U/ml尖吻蝮蛇血凝酶、立止血、凝血酶与0.5ml标准人血浆混匀后在37℃条件下充分孵育,待凝块形成后,将凝块取出,用滤纸吸干其水分后称重,然后将凝块置于5ml 5mol/L尿素溶液中,静置18h,观察并记录血凝块的溶解情况,称量血凝块溶解后重量,计算溶解率。3.2.2体内血栓溶解性研究SD大鼠静脉注射各实验药物,给药后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,仰卧固定于手术台,于腹中线纵向切开皮肤约3cm,从腹白线处打开腹腔,钝性分离下腔静脉,于左肾静脉下方用4号缝合线结扎下腔静脉,同时结扎下方两条主要分支静脉,缝合腹壁,3h后重新打开腹腔,在结扎处下方约2cm处用4号缝合线结扎,将该段管腔内血液吸尽,纵行剪开,观察有无血栓形成,如有则取出血栓称湿重。然后将血栓置于5ml 5mol/L尿素溶液中,静置18h,观察并记录血栓的溶解情况,称量溶解后的血栓湿重,计算溶解率。3.2.3 HCA对肝素化血浆凝固作用实验将0.05mol/L Tris-HCl （pH7.4）缓冲液、4U/mlHCA溶液、4U/ml立止血溶液、8U/ml人凝血酶溶液分别与肝素化标准人血浆混匀后于37℃充分水浴4h。水浴结束后,倾倒上清液,用大量0.15mol/L的NaCl溶液冲洗凝块,然后向每个反应体系中加入1ml 5mol/L的尿素溶液（内含2%SDS,2%β-琉基乙醇,0.1mol/L磷酸钠,pH7.15）以终止反应,室温放置24h,将溶解后的样品与SDS-PAGE上样缓冲液4：1混合,沸水煮3-5min,取15μl小心上样,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。3.2.4 HCA对凝血因子ⅩⅢ直接作用实验将0.05mol/L Tris-HC1 （pH7.4）缓冲液、4U/mlHCA溶液、4U/ml立止血溶液、8U/ml人凝血酶溶液分别与FXⅢ溶液混匀后于37℃水浴锅中孵育,分别于孵育30min、1h、2h、4h时取出100μl混合溶液,加入等量9mol/L的尿素溶液（内含2%SDS,2%β-琉基乙醇）以终止反应,将上述样品与SDS-PAGE上样缓冲液4：1混合,沸水煮3-5min,取15μl小心上样,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。3.3 HCA对凝血因子X （Coagulation FactorX, FX）的作用将0.05mol/L Tris-HCl （pH7.4）缓冲液、4U/mlHCA溶液、4U/ml立止血溶液、8U/ml人凝血酶溶液分别与FX溶液于37℃充分水浴2h。然后向每个反应体系中加入60μl 10mol/L的尿素溶液（内含2%SDS,2%0-琉基乙醇）以终止反应,将上述样品与SDS-PAGE上样缓冲液4：1混合,沸水煮3-5min,取15μl小心上样,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。结果1、HCA在浓度分别为0.5U/ml、0.75U/ml、1.0U/ml时,对等量纤维蛋白原作用所形成的凝块重量分别为30.6mg、30.1mg、29.8mg,大小几无差别,故试验选取HCA的最适实验浓度为0.5U/ml。2、HCA与标准人血浆作用下形成的凝块大小为24.4±1.5mg,与立止血、凝血酶作用下形成的凝块大小相差不大,表明三者之间体外凝血效果相当。3、HCA与人纤维蛋白原作用下形成的凝块大小为28.5±1.7mg,与立止血作用下形成的凝块大小相差不大,这表明HCA与立止血对于纤维蛋白原的裂解能力相当。4、HCA高剂量组昆明小鼠的剪尾出血时间为71.7±21.2s,与阴性对照组比较,差异有统计学意义。实验同时表明,阳性对照药立止血也能显著缩短小鼠剪尾出血时间。5、3U/kg剂量水平尾静脉注射HCA后形成的血栓重量为20.2±3.3mg,显著大于阴性对照组（P<0.001）；与立止血组相比,差异无统计学意义。这表明HCA与立止血在大鼠体内的凝血效果无差异。6、HCA与人纤维蛋白原作用时,仅释放FpA片段,其保留时间为8.8min,随着孵育时间延长,体系中FpA（峰面积）含量逐渐增加；而凝血酶与人纤维蛋白原作用时,同时释放FpA、FpB片段,其保留时间分别为8.7min、18.5min。7、HCA与人纤维蛋白原作用时,随着孵育时间延长,体系中α亚基带逐渐变浅,12h时α亚基带基本消失,这说明HCA能够降解人纤维蛋白原肽链中的α亚基。8、HCA在体外作用于血浆时形成的凝块溶解率为100%,而立止血、凝血酶在体外作用于血浆时形成的凝块只能够部分溶解,且与HCA组比较,组间差异具有显著性意义（P<0.001）,由此可以推断HCA不能够激活血浆中存在的ⅩⅢ因子。9、HCA作用下体内形成血栓的溶解率为75.3±2.8%,显著大于其它试验组,且组间差异有统计学意义（P<0.001）,由此可以推断HCA不能够激活血浆中存在的ⅩⅢ因子。10、肝素能够抑制凝血酶的凝血作用,但是对于HCA和立止血的凝血效果没有影响。同时因为有肝素的存在,也间接证明了HCA不激活凝血酶原复合物及ⅩⅢ因子。11、HCA对FⅩⅢ不具有裂解作用,因此HCA不能激活ⅩⅢ因子。。12、HCA对FX不具有裂解作用,因此不能够激活Ⅹ因子。结论1、HCA在体内外具有良好的凝血效果,其凝血能力与立止血相当。2、HCA不激活ⅩⅢ因子,不会导致血管内弥漫性凝血。3、HCA不激活Ⅹ因子,不易于凝血瀑布的激发放大,因此不会造成由于凝血瀑布的激发放大而导致的血栓形成。4、肝素对HCA的凝血效果没有影响。5、HCA能够水解纤维蛋白原的α亚基,裂解出A肽片段（FpA）,形成纤维蛋白单体（αBβγ）2,并聚合成纤维蛋白多聚体,从而发挥止血作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 实验材料与仪器
• 1.1 实验药物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验动物
• 1.5 主要溶液配制方法
• 第二部分 实验方法与结果
• 1 HCA体外药效评价部分
• 1.1 HCA对体外凝块形成的最适浓度研究
• 1.2 含凝血因子ⅩⅢ药效实验
• 1.3 不含凝血因子ⅩⅢ药效实验
• 2 HCA体内药效评价部分
• 2.1 小鼠剪尾出血时间测定实验
• 2.2 大鼠体内血栓实验
• 3 作用机制部分
• 3.1 HCA对凝血因子Ⅰ（Coagulation FactorⅠ,FⅠ）的作用
• 3.2 HCA对凝血因子ⅩⅢ（Coagulation FactorⅩⅢ,FⅩⅢ）的作用
• 3.3 HCA对凝血因子Ⅹ（Coagulation FactorⅩ,FⅩ）的作用
• 第三部分 讨论
• 第四部分 结论
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 硕士期间论文发表情况
• 致谢
• 统计学审稿证明