论文摘要
1.△12脂肪酸脱氢酶的克隆与反义表达载体的构建花生脂肪酸组分中含量最高的是油酸和亚油酸,油酸/亚油酸（O/L）比率是影响花生耐贮藏性的主要指标。△12脂肪酸脱氢酶是催化油酸转变为亚油酸的关键酶。本研究根据Genbank上发表的△12脂肪酸脱氢酶基因（ahFAD2B）的序列设计引物,以花生2005D029（国槐DNA导入79266后选育的品系）幼嫩叶片为材料,提取基因组DNA,以此为模板经多聚合酶链式反应（PCR）扩增,回收PCR产物与克隆载体pGM-Teasy连接,获得重组质粒pFAD2B,序列分析表明,PCR产物为约1200bp的DNA片断,与Genbank发表的ahFAD2B序列AF248739的同源性为97%。重组子pFAD2B和质粒pBI121分别用BamHⅠ和SacⅠ双酶切,并回收目的基因片断和切除GUS基因的pBI121载体DNA,经连接构建成ahFAD2B基因的反义表达载体。2.影响农杆菌介导花生基因转化因素的研究以花生胚小叶为外植体,用携带有γ-维生素E甲基转移酶基因（γ-tmt）和筛选标记基因bar植物表达载体（质粒为pGBVE ,根癌农杆菌为GV3101）进行基因转化,设置了在农杆菌侵染时添加不同浓度烟草叶片提取液、超声波处理及在农杆菌菌液活化和共培养阶段添加不同浓度乙酰丁香酮（AS）等试验,研究了对花生基因转化的影响。主要结果如下:（1）适宜时间的超声波处理可有效提高花生基因转化率外植体在菌液中侵染时间均为15min,同时将盛有外植体和菌液的三角瓶置于超声波清洗器中央进行不同时间长度的处理,分别为0、2、4、6、8、10、15min 7种处理时间长度。以最终获得的抗性苗数比处理的外植体数计算转化率。7个处理的转化率分别为0.79%、0.72%、1.12%、1.30%、0.42%、0、0。超声波处理适宜的时间长度则可提高转化率,以处理6min效果最明显,转化率比对照高65%,处理8min以上则转化率降低,处理10min以上转化率为0。另外,超声波处理均不同程度的影响分化出苗,处理10min以上严重影响分化出苗,处理15min则不能分化出苗。（2）添加适量烟草提取液可有效提高花生基因转化率农杆菌侵染时菌液中加入烟草提取液,浓度设置0、37.5、75、112.5、150mg/ml（烟草幼叶鲜重/菌液体积）5个水平,以最终获得的抗性苗数比处理的外植体数计算转化率。结果表明,烟草提取液浓度为112.5mg/ml时,转化率最高,达到1.58%,是对照的2.26倍。低浓度的37.5、75mg/ml处理,转化率亦显著高于对照,而150mg/ml浓度则转化率低于对照。试验中还发现,烟草提取液能促进芽丛的分化和农杆菌的繁殖。（3）添加AS不能提高花生的基因转化率在活化农杆菌或共培养的培养基中加入AS,培养基中AS浓度均设置为0、50、100、150、200μmol/L 5个水平。结果表明,无论在活化农杆菌时还是共培养时加入AS,50和100μmol/L两种浓度对提高花生基因转化率的作用不明显,而150和200μmol/L时,基因转化率明显下降。