内皮祖细胞在小型猪创伤后多脏器功能障碍的变化及意义

论文摘要

1997年Asahara等首先从外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells PMCs）里分离出一种被称为内皮祖细胞（endothelial progenitor cells EPCs）的祖细胞亚群,这些细胞可以在体内外增殖、迁徙,并能分化为成熟内皮细胞。多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome MODS）是临床危重患者死亡的主要原因之一。目前其发病机制尚不完全明确,临床上尚缺乏令人欣喜的治疗措施。随着干/祖细胞研究的不断深入,多器官功能障碍综合征的发病机制研究和临床治疗面临着新的契机。有研究表明,机体损伤后血循环中具有多向分化潜能的祖细胞一方面可以在某些细胞因子作用下动员、增殖、迁徙入损伤器官,分化为相应的内皮细胞进行损伤修复;另一方面内皮细胞不仅是炎症反应的参与者,还是首先受损的靶细胞,并进而造成微血管损伤、微循环障碍,这可能是器官功能障碍的始发环节。大量的动物和临床实验都已经证明:当组织受到损伤时,尤其是缺血性损伤时,循环及组织中EPCs动员和增殖能力增强,并可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修补裸露的血管内皮损伤区,并参与缺血或损伤组织内新血管生成,从而改善缺血器官的功能;而如果创伤后EPCs的分化、迁徙功能发生严重障碍,则会导致损伤微循环严重损害而无法得到修复,甚至发生器官功能衰竭。本实验利用猪骨髓体外培养出EPCs并传代扩增,探讨它的培养条件增殖规律,并对培养的EPCs进行鉴定。利用“二次”打击法建立小型猪MODS动物模型。用流式细胞仪测定外周血和骨髓中内皮祖细胞的数量,找出外周血和骨髓中内皮祖细胞在打击后出现MODS过程中升高和降低的规律。整个实验分三部分论述:第一部分研究小型猪骨髓EPCs的体外分离、定向分化、扩增培养方法,为EPCs移植应用临床提供实验依据。方法:抽取小型猪新鲜骨髓20ml,用密度梯度离心法从中分离单个核细胞,将单核细胞悬液按1×106/ml密度接种于直径10厘米含血管内皮生长因子等各种添加剂的内皮细胞系列专用培养液培养皿中培养,诱导其向内皮细胞分化,观察经过不同时间培养后的细胞生长情况并进行EPCs诱导分化后的生物学鉴定,包括细胞免疫组化鉴定、流式细胞仪检测细胞表型、Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）摄取试验、超微结构鉴定、体外血管生成实验。结果:培养2天可出现贴壁细胞增大变形,6天后梭形样细胞数明显增多,部分成鹅卵石状贴壁生长,进而形成细胞网或者管腔样结构。培养后的细胞传至第3代后,用CD133、CD34和VEGFR-2单抗免疫组织化学检测为阳性,FITC-UEA-I和Dil-acLDL双吞噬实验为阳性,血管生成实验为阳性,FCM检测贴壁细胞高表达VEGFR-2（76±6.21%）,CD34（26.4±5.39%）,和CD133（16.4±2.25%）,鉴定为EPCs。10d后出现多个细胞簇,呈集落样生长,14d左右可观察到条索状、网状血管样结构,原代细胞培养21d左右接近融合并且呈典型的鹅卵石样排列。第7-14d有大于98%的细胞Flk-1,vWF’CD31表达阳性,CD34+细胞为（26.0±2.82）%,有95%以上的细胞Dil-acLDL摄取试验阳性,在血管生成实验中,血管内皮生长因子显著促进EPCs形成小管的数量与复杂程度,呈一定的量效关系。结论:密度梯度离心法体外分离骨髓血中单个核细胞可以用于进行EPCs培养实验研究,单个核细胞在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮细胞。贴壁因子、血管内皮生长因子等对于体外培养EPCs有很重要的作用。第二部分利用改良Wiggers方法复制失血性休克模型,首次打击(失血性休克、复苏再灌注和二次打击（内毒素）复合因素成功建立猪MODS模型。方法:19头猪随机分为实验组（M组,失血性休克+复苏再灌注+内毒素组,n=10）;正常对照组（C组,n=9）,通过给猪放血致平均动脉压50±5mmHg,维持1.5-2h,然后回输60%所失血液和两倍平衡液复苏,12h后由静脉持续滴入内毒素（sigma,剂量1mg/Kg）,24小时滴完。连续动态监测心、肺、肾、肝、胃肠等功能,七天后处死存活动物。用自动分析仪检测各时间点ALT、AST、Cr、BUN、CO、PaO2等指标,观察主要器官病理形态学变化。结果:M组外周血ALT、AST、Cr、BUN均明显升高,动物死亡前显著高于正常值（P＜0.01）,CO,PaO2明显下降（P＜0.01）;病理学改变主要以非特异炎症改变为主。M组各器官的衰竭率:肺80.0%（8例）,胃肠道70.0%（7例）,肝50.0%（5例）,肾30.0%（3例）,心功能障碍（2例）20.0%,MODS发生率达90.0%（9例）,死亡率达80.0%（8例）,显著高于对照组。结论:利用二次打击方法,可以成功复制出动物MODS模型,且模型MODS发生率高,死亡率高,与临床典型的双相迟发MODS相似重复性好。第三部分观察小型猪骨髓内皮祖细胞在创伤后多器官功能障碍的变化及意义,找出外周血和骨髓中内皮祖细胞在打击后出现MODS过程中升高和降低的规律。方法:在整个动物实验过程中的不同时间点（设五个时间点T1、T2、T3、T4、T5）抽取骨髓和外周血各3ml,取1ml加入红细胞裂解液后在显微镜下行“四格法”计数,计算出每毫升标本中白细胞的数量。取流式试管加入标本和CD133、KDR的一抗和二抗,用流式细胞仪测定外周血和骨髓中内皮祖细胞的数量,以计数所得白细胞的数量乘以流式所得百分含量,得出EPCs数值,对结果进行统计学分析。结果:正常骨髓和外周血EPCs数量为7.64±0.68×106/L,3.54±0.26×106/L。骨髓白细胞和外周血白细胞先有明显下降之后明显升高（P＜0.05）,但是外周血白细胞上升不如骨髓中白细胞上升幅度大（P＜0.05）。流式细胞仪结果显示骨髓中EPCs的含量在受到创伤后明显升高（P＜0.05）。外周血中EPCs的含量在创伤早期（T2、T3）显著升高（P＜0.01）,之后下降（P＜0.05）。特别在出现MODS后持续下降,病情越重下降幅度越大。结论:小型猪正常骨髓EPCs数量外周血中的数量;创伤后MODS过程中血液中的内皮祖细胞先出现明显升高,然后迅速下降;创伤后骨髓EPCs先略有下降,后明显升高,出现MODS后下降,死亡前明显下降。结论:利用密度梯度离心法体外分离猪骨髓中单个核细胞可以用于进行EPCs培养研究,体外培养EPCs可以成功传代扩增。单个核细胞在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮细胞,贴壁因子、血管内皮生长因子等对于体外培养EPCs有很重要的作用。利用“二次”打击法可以成功复制出动物MODS模型,且模型MODS发生率高,死亡率高,与临床典型的双相迟发MODS相似重复性好。在此基础上用流式细胞仪测定外周血和骨髓中内皮祖细胞的数量,找出外周血和骨髓中内皮祖细胞在打击后出现MODS过程中升高和降低的规律。小型猪正常骨髓EPCs数量高于外周血中的数量;创伤后MODS过程中血液中的EPCs先出现明显升高,然后迅速下降;创伤后骨髓EPCs先略有下降,后明显升高,出现MODS后下降,死亡前明显下降。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 前言
• 第一部分 小型猪骨髓内皮祖细胞分离、培养、鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 多器官功能障碍动物模型的建立
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 内皮祖细胞在创伤后多脏器功能障碍的变化及意义
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 致谢