高效水解大豆异黄酮β-葡萄糖苷酶及其对肉公鸡生产性能的影响研究

论文摘要

本课题筛选了高产β-葡萄糖苷酶的菌种,并研究黑曲霉的发酵特性和酶学特性,优化了β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的最佳条件,对β-葡萄糖苷酶基因进行了克隆和序列分析；并以艾维茵肉用公雏为试验对象,研究了β-葡萄糖苷酶对肉公鸡生长、大豆异黄酮的吸收代谢、肉质、脂肪代谢、抗氧化能力及激素水平的影响,从而揭示了β-葡萄糖苷酶的促生长机理。1.菌种筛选和鉴定从自然界筛选的6个菌种进行发酵产β-葡萄糖苷酶的研究,结果表明,zju2的固体发酵和液体发酵产β-葡萄糖苷酶活性均最高,说明zju2最适合用于发酵生产β-葡萄糖苷酶；对zju2的基因组进行提取,采用真菌通用引物对菌种18SrDNA进行PCR扩增及产物克隆,并进行序列分析,序列用BLAST程序和GenBank数据库进行同源性比较分析,结果表明该菌种与黑曲霉（Aspergillus nigerD63697）同源性高达99%,进化树距离最近,综合菌落形态和产孢子性能,该菌种被鉴定为黑曲霉,命名为黑曲霉zju2 （A.niger zju2）。2.黑曲霉zju2发酵特性研究本试验以黑曲霉zju2为出发菌株,对其产β-葡萄糖苷酶最佳固体培养基和发酵条件进行了优化。结果表明,以麸皮为主要培养基,玉米芯粉比率20%以下或米糠比率10%以下,适合黑曲霉产β-葡萄糖苷酶,单独使用麸皮为固体培养基更适宜黑曲霉生长；黑曲霉产β-葡萄糖苷酶不需添加碳源；添加2%的无机氮（硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和尿素）,均可提高酶活性,添加量高于2%时,显著降低β-葡萄糖苷酶活性；分别添加2-6%蛋白胨、4%酵母提取物、2%豆粕和4%棉籽粕,β-葡萄糖苷酶活性显著提高。培养基含水量为70%、接种量为107cfu/g培养基、培养基pH6.0、发酵温度28℃和培养时间72h为黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的最优条件,优化后酶活高达508U/g。3.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究采用酶学研究方法,通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100纯化了β-葡萄糖苷酶,并进行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及米氏常数等特性研究；采用SDS-PAGE凝胶电泳测定了分子量。研究表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃、最适反应pH为4.5；在40℃、50℃和60℃下较稳定,80℃以上稳定性差；β-葡萄糖苷酶在pH为3、7、8、9的缓冲液中的稳定性很差,在pH为4、5、6的缓冲液中稳定性较好,其中在pH为5时,稳定性最好；酶的Km=41.67mM, Vmax=23.81U/L;其分子量为65.2kDa。4.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶体外酶解效率研究选用含量40%的大豆异黄酮（结合型占86.33%）和黑曲霉产β-葡萄糖苷酶为研究对象,以水解时间、温度和酶量为试验因素,以酶解产物游离型苷元含量为判断标准,采用三因素五水平二次回归通用旋转组合设计方案进行研究。结果表明：在游离型苷元含量（y）与反应时间、反应温度与酶量之间可建立数学模型：（?）=0.876+0.029 X1-0.071 X2+0.072 X3-0.048X1X2+0.015 X1X3+0.017X2X3-0.035 X12-0.074 X22-0.091 X32,模型的复相关系数为0.86,达极显著水平,模型有效；在本试验所选水平范围内,对水解率的影响程度大小依次为：酶量>温度>时间。通过优化,黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的最佳反应参数为时间5.3h,温度55.4℃,酶量68.7 U/g。5.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶基因克隆及序列分析试验采用Trizol法提取总RNA,以反转录出的cDNA为模板进行PCR扩增,并进行序列测定及结构预测。研究表明,黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因全长2583bp,编码860个氨基酸,理论分子量为93.2kDa,理论等电点为4.45。结构预测表明,β-葡萄糖苷酶信号肽切割位点在第19个氨基酸和第20个氨基酸之间,β-葡萄糖苷酶成熟肽片段为841个氨基酸,理论分子量为91.2kDa；成熟肽中含有15个潜在的糖基化位点；二级结构预测表明,该蛋白中含无规卷曲568个,占67.54%,α-螺旋为165个,占19.62%,含折叠108个,占12.84%；该酶与蛋白质库中1ex1具有相似的三维构象,同源性为23.7%。6.β-葡萄糖苷酶对肉公鸡生产性能的影响及机理研究选用1日龄的艾维茵肉用公雏为试验对象,设对照组和添加0.2%（0.6U/g饲粮）、0.4%（1.2U/g饲粮）及0.6%（1.8U/g饲粮）酶制剂的试验组,每组设4个重复,每个重复15羽,研究该酶对肉公鸡生长的影响并探讨其作用机理。试验表明：（1）β-葡萄糖苷酶能改善生产性能：饲粮中添加0.2%（0.6U/g饲粮）的β-葡萄糖苷酶使肉鸡日增重显著提高了8.26%（p<0.05）,添加0.2%、0.4%和0.6%β-葡萄糖苷酶分别使料重比降低了5.8%（p<0.01）、2.68%（p<0.01）和2.23%（p<0.05）。（2）饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶能提高大豆异黄酮的利用率：β-葡萄糖苷酶对大豆异黄酮的吸收和代谢有显著的影响,使肉鸡血清中结合型大豆异黄酮降低了68.02%。（3）饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶能改善肉质：使肉公鸡滴水损失率降低了22.00%（p<0.05）,胸肌L·值降低了11.17%（p<0.01）,胸肌a·值提高了41.81%（p<0.01）。（4）饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶能提高消化机能：添加0.2%β-葡萄糖苷酶使肉鸡胰重率显著降低了18.08%（p<0.05）,肝重率降低了8.19%（p>0.05）；β-葡萄糖苷酶使肉鸡十二指肠淀粉酶活性提高了30.43%（p<0.05）,脂肪酶和胰蛋白酶分别提高12.40%（p>0.05）和57.93%（p>0.05）。β-葡萄糖苷酶使肉鸡粗蛋白和粗脂肪消化率显著提高了9.02%（p<0.05）和7.40%（p<0.01）。（5）饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶对骨骼生长发育无显著影响：对肉公鸡的股骨、胫骨生长无明显影响,与骨骼生长相关的血清指标钙、磷和碱性磷酸酶也无显著变化。（6）饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶对脂肪代谢某些指标产生影响：β葡萄糖苷酶对肉鸡的腹脂沉积、肌肉之间的脂肪沉积和尾部脂肪沉积都无显著影响,β-葡萄糖苷酶对肉鸡脂肪组织中HSL和LPL的活性均无显著影响；β葡萄糖苷酶对肉公鸡甘油三酯、游离脂肪酸和总胆固醇没有显著影响,高密度脂蛋白胆固醇显著提高了15.10%（p<0.05）,低密度脂蛋白胆固醇降低了36.43%（p<0.01）。（7）β-葡萄糖苷酶提高肉鸡的抗氧化能力：显著提高了肉鸡血清中超氧化物歧化酶的活性提高了16.45%（p<0.05）,而使丙二醛的含量降低18.16%（p<0.05）,肝脏中谷胱苷肽过氧化物酶和谷胱苷肽还原酶活性分别提高了33.00%（p<0.05）和14.88%（p<0.05）。（8）β-葡萄糖苷酶能促进激素分泌：睾酮和雌二醇分别提高了51.43%（p>0.05）和14.59%（p>0.05）,IGF-I提高了57.78%（p<0.05）。研究表明,β-葡萄糖苷酶可以在肉鸡消化道酶解结合型大豆异黄酮,提高大豆异黄酮的利用率,从而改善肉鸡生产性能。

论文目录

• 致谢
• 引言
• 中文摘要
• Abstract
• 主要英文缩写
• 第一篇 文献综述
• 1.1 β-葡萄糖苷酶研究进展
• 1.1.1 自然界中的β-葡萄糖苷酶
• 1.1.2 β-葡萄糖苷酶的活性测定
• 1.1.3 β-葡萄糖苷酶的提取与纯化
• 1.1.4 β-葡萄糖苷酶的理化特性
• 1.1.4.1 分子量
• 1.1.4.2 最适反应温度和热稳定性
• 1.1.4.3 等电点（pI）、最适pH和pH稳定性
• 1.1.5 β-葡萄糖苷酶的催化反应机制
• 1.1.5.1 反应机制
• 1.1.5.2 活性中心结构
• 1.1.5.3 底物特异性
• 1.1.5.4 催化反应影响因素
• 1.1.6 β-葡萄糖苷酶的最优培养条件
• 1.1.7 β-葡萄糖苷酶基因克隆和表达
• 1.1.8 β-葡萄糖苷酶的应用
• 1.1.8.1 生产低聚龙胆糖
• 1.1.8.2 改善果汁风味
• 1.1.8.3 果酒增香作用
• 1.1.8.4 茶叶增香作用
• 1.1.8.5 烟草增香作用
• 1.1.8.6 生产大豆异黄酮苷元
• 1.1.8.7 在纤维素降解中的应用
• 1.2 大豆异黄酮的研究进展
• 1.2.1 大豆异黄酮的种类与结构
• 1.2.2 大豆异黄酮含量分析方法
• 1.2.3 大豆异黄酮含量与分布
• 1.2.4 大豆异黄酮的吸收与代谢机制
• 1.2.4.1 大豆异黄酮的吸收部位和时间
• 1.2.4.2 大豆异黄酮在肠道中的代谢
• 1.2.4.3 影响大豆异黄酮代谢的因素
• 1.2.5 大豆异黄酮的生理功能
• 1.2.5.1 类雌激素与抗雌激素作用
• 1.2.5.2 抗氧化活性
• 1.2.5.3 提高机体免疫力
• 1.2.5.4 调节血脂及预防心血管疾病
• 1.2.5.5 抗癌作用
• 1.2.5.6 改善骨质疏松的作用
• 1.2.5.7 影响物质代谢
• 1.2.6 大豆异黄酮的毒性
• 1.2.7 大豆异黄酮的水解
• 1.2.8 大豆异黄酮在动物生产中的应用
• 1.2.8.1 提高动物生产性能
• 1.2.8.2 改善动物的繁殖性能
• 1.2.8.3 对动物其它方面的影响
• 1.3 研究目的和意义
• 第二篇 研究报告
• 第一章 菌种筛选和鉴定
• 摘要
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.1.1 菌种
• 1.1.1.2 主要试剂
• 1.1.1.3 菌种鉴定培养基
• 1.1.2 方法
• 1.1.2.1 种子培养
• 1.1.2.2 液体发酵培养
• 1.1.2.3 固态发酵培养
• 1.1.2.4 粗酶液浸提
• 1.1.2.5 β-葡萄糖苷酶活性测定
• 1.1.2.6 菌种的分离筛选
• 1.1.2.7 真菌基因组DNA的制备
• 1.1.2.8 18S rDNA基因的PCR扩增
• 1.1.2.9 PCR产物克隆
• 1.1.2.10 序列分析
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 不同菌种液体发酵产β-葡萄糖苷酶活性
• 1.2.2 不同菌种固体发酵产β-葡萄糖苷酶活性
• 1.2.3 菌株的形态特征
• 1.2.4 目的基因PCR扩增
• 1.2.5 PCR产物克隆
• 1.2.6 序列分析
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 第二章 黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵特性研究
• 摘要
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 微生物
• 2.1.1.2 试剂及其它原料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 种子培养
• 2.1.2.2 β-葡萄糖苷酶固体培养基的优化
• 2.1.2.3 β-葡萄糖苷酶的发酵条件优化
• 2.1.2.4 β-葡萄糖苷酶活性测定
• 2.1.2.5 含水量的分析与计算
• 2.1.2.6 干物质失重率和发酵产率计算
• 2.1.2.7 培养基pH值测定
• 2.1.2.8 统计分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的固体培养基优化
• 2.2.1.1 麦麸和玉米芯粉对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.2.1.2 麦麸和米糠对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.2.1.3 不同碳源对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.2.1.4 不同氮源对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.2.2 黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的培养条件优化
• 2.2.2.1 培养基含水量对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.2.2.2 菌种接种量对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.2.2.3 培养基pH对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.2.2.4 温度对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.2.2.5 发酵时间对微生物产β-葡萄糖苷酶水平的影响
• 2.3 结论
• 第三章 黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究
• 摘要
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 β-葡萄糖苷酶
• 3.1.1.2 仪器与试剂
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 粗酶液的提取及活性测定
• 3.1.2.2 硫酸铵分级沉淀
• 3.1.2.3 Sephadex G-25脱盐
• 3.1.2.4 Sephadex G-100凝胶层析
• 3.1.2.5 蛋白凝胶电泳法测定分子量
• 3.1.2.6 酶最适反应温度
• 3.1.2.7 酶最适反应pH
• 3.1.2.8 酶热稳定性
• 3.1.2.9 酶pH稳定性
• 3.1.2.10 米氏常数测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 酶的提取纯化及其分子量
• 3.2.1.1 粗提酶液活性
• 3.2.1.2 硫酸铵分级沉淀后活性
• 3.2.1.3 硫酸铵盐沉淀后β-葡萄糖苷酶脱盐
• 3.2.1.4 β-葡萄糖苷酶纯化
• 3.2.1.5 SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.2.2 β-葡萄糖苷酶的酶学特性
• 3.2.2.1 酶的最适反应温度
• 3.2.2.2 酶的最适反应pH
• 3.2.2.3 酶的热稳定性
• 3.2.2.4 酶pH稳定性
• 3.2.2.5 酶的米氏常数
• 3.3 结论
• 第四章 黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解结合型大豆异黄酮效率研究
• 摘要
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 试验方法
• 4.1.3.1 大豆异黄酮的酶解
• 4.1.3.2 β-葡萄糖苷酶活测定
• 4.1.3.3 大豆异黄酮的检测
• 4.1.3.4 水解条件优化
• 4.1.3.5 数据统计及分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 水解效率与模型的建立
• 4.2.2 各因素对水解后游离型苷元含量的影响
• 4.2.3 模型的优化
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 第五章 黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及序列分析
• 摘要
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.1.1 供试菌株
• 5.1.1.2 主要试剂
• 5.1.1.3 引物设计
• 5.1.1.4 培养基及主要化学试剂的配制
• 5.1.1.5 主要试验仪器
• 5.1.2 试验方法
• 5.1.2.1 菌种培养
• 5.1.2.2 总RNA抽提（TRIzol法）
• 5.1.2.3 反转录
• 5.1.2.4 PCR扩增黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因序列
• 5.1.2.5 PCR产物电泳检测及割胶回收
• 5.1.2.6 DNA回收产物与质粒载体连接
• 5.1.2.7 感受态细胞的制备与目的DNA的转化
• 5.1.2.8 阳性克隆子的筛选
• 5.1.2.9 重组DNA核苷酸序列分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 RNA提取与质控
• 5.2.2 RT-PCR扩增
• 5.2.3 阳性克隆子的筛选与鉴定
• 5.2.4 序列分析
• 5.2.5 结构预测
• 5.2.5.1 黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因信号肽切割位点预测
• 5.2.5.2 黑曲霉β-葡萄糖苷酶成熟肽N-糖基化位点预测
• 5.2.5.3 黑曲霉β-葡萄糖苷酶成熟肽二级结构预测
• 5.2.5.4 黑曲霉β-葡萄糖苷酶成熟肽三维结构预测
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 第六章 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡生产性能的影响及机理研究
• 摘要
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 试验方法
• 6.1.2.1 饲养试验
• 6.1.2.2 消化试验
• 6.1.2.3 屠宰试验
• 6.1.2.4 血清中生化指标测定
• 6.1.2.5 肝脏中GSH-PX、GR指标和粗脂肪测定测定
• 6.1.2.6 腹脂中LPL和HSL指标测定
• 6.1.2.7 十二指肠内容物中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性测定
• 6.1.2.8 豆粕和血清中大豆异黄酮含量测定
• 6.1.2.9 饲料、肠内容物和粪中β-葡萄糖苷酶活性及水分测定
• 6.1.2.10 切片制作
• 6.1.3 数据分析与统计
• 6.2 研究结果
• 6.2.1 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡生产性能的影响
• 6.2.2 β-葡萄糖苷酶活性在肠道中的变化规律
• 6.2.3 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡血清中大豆异黄酮含量的影响
• 6.2.4 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡机体组成和肉质的影响
• 6.2.5 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡消化机能的影响
• 6.2.5.1 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡消化器官重量的影响
• 6.2.5.2 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡十二指肠绒毛的影响
• 6.2.5.3 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡十二指肠消化酶活性的影响
• 6.2.5.4 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡营养物质表观消化率的影响
• 6.2.6 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡骨骼生长发育的影响
• 6.2.7 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡脂肪代谢的影响
• 6.2.7.1 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡脂肪沉积的影响
• 6.2.7.2 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡脂肪组织中激素的影响
• 6.2.7.3 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡血清中脂肪代谢相关指标的影响
• 6.2.8 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡抗氧化的影响
• 6.2.9 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡血清生长激素的影响
• 6.3 讨论
• 6.3.1 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡生产性能的影响
• 6.3.2 饲粮中的β-葡萄糖苷酶活性及其在肉公鸡肠道中的变化
• 6.3.3 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡大豆异黄酮吸收和代谢的影响
• 6.3.4 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡机体组成和肉质的影响
• 6.3.5 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡消化机能的影响
• 6.3.6 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡骨骼生长发育的影响
• 6.3.7 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡脂肪代谢的影响
• 6.3.8 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡抗氧化能力的影响
• 6.3.9 β-葡萄糖苷酶对肉公鸡体内激素水平的影响
• 6.4 小结
• 第三篇 结论
• 1.1 小结
• 1.2 创新点
• 1.3 后续研究展望
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和主要发表及录用的论文