论文摘要
研究背景在过去的数十年里,我们已经取得了关于白色脂肪组织在新陈代谢和内分泌功能的许多知识。占成人体重20-30%的白色脂肪组织是机体重要的能量储存场所,对维持高等动物体内能量平衡起了非常重要的作用。脂肪酸（FA）以甘油三脂（TAG）的形式存储于脂肪细胞内。长期饥饿可增强脂肪细胞内TAG分解为FA和甘油,为机体提供FA作为能量源泉,这个过程称为脂解。肥胖、恶病质、代谢综合症和脂肪营养不良等疾病均能刺激脂肪组织分解增强,FA释放增多。高FFA血症导致FA异位沉积于非脂肪组织尤其是肝脏和骨骼肌内,与胰岛素抵抗和2型糖尿病的进展密切相关,是动脉粥样硬化和心血管疾病的重要危险因素。慢性肾衰（CRF）是一种慢性炎症消耗性疾病,存在脂肪量减少,脂质存储和动员异常现象。大量实验证明体内脂质分解增强是癌症病人脂肪量减少的主要原因。在我们前面的研究结果中,发现CRF大鼠内脏和皮下脂肪组织确实存在脂质分解增强现象,CRF大鼠血清甘油浓度、内脏和皮下原代脂肪细胞及脂肪块培养所测甘油含量均增加。激素动员情况下,皮下和内脂的脂解率显著增高,慢性肾衰组对激素动员的反应比假手术组更高。CRF组织脂质分解增强可能与其胰岛素抵抗和动脉粥样硬化发生率增高密切相关,但CRF中脂解增强的具体机制目前仍不清楚。我们前面的实验结果显示,CRF组内脏脂肪脂质分解酶hormone-sensitive lipase （HSL）和adipocyte triglyceride lipase （ATGL）的酶活性增加,皮下脂肪脂质分解酶HSL和ATGL不仅酶活性增加,表达也增多可以部分解释CRF脂解增强的发生机制。ATGL和HSL是脂质分解的关键酶,共占据了大鼠白色脂肪组织脂质分解酶的95%以上。ATGL的主要作用是将TAG分解为甘油二酯（DG）和FA, HSL将DG分解为甘油一酯和FA, HSL多个磷酸化位点活化后可增强脂解活性。脂肪组织不仅是能量储存场所,同时也是一个活跃的内分泌器官。近年来的研究发现,不仅脂肪组织增多可引起胰岛素抵抗,脂肪组织减少也可参与胰岛素抵抗的发生。在肥胖患者,脂肪组织局部炎症增强被认为是肥胖患者发生胰岛素抵抗的核心环节。单核巨噬细胞浸润增加,使leukin-6 （IL-6）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,单核细胞趋化蛋白（MCP-1）和其他炎症因子产生增多。由脂肪细胞和巨噬细胞产生的TNF-α和IL-6能刺激脂解。脂肪组织促炎症因子IL-6和TNF-α分泌增多被证明是癌症恶病质脂解增强的重要因素。TNF-α与膜受体TNFR1结合,激活下游MAPK激酶ERK1/2和JNK, TNF-α通过降低perilipinA蛋白表达水平并增强perilipinA蛋白的磷酸化使脂解增强。IL-6是有多种功能的细胞因子,脂肪组织是IL-6分泌的主要部位。最近的研究指出血清IL-6浓度与脂肪细胞脂解是密切相关的。比如,2型糖尿病患者血清IL-6和FFA水平都是显著增加,提示IL-6可能是脂解的一个重要诱导因子。此外,将人乳腺脂肪细胞和3T3-L1脂肪细胞与IL-6共同孵育24h后,脂解率显著增强。总之,这些实验都证实了高剂量IL-6在体内和体外均能刺激脂解并氧化脂肪。并且研究发现IL-6是通过激活ERK通路,降低perilipinA蛋白的表达直接刺激猪脂肪细胞脂解。有研究证明,在人脂肪细胞中,Nuclear factor-KB （NF-κB）的激活对TNFα诱导脂解也同样非常重要,TNFα与NF-κB结合后,perilipinA蛋白的水平降低。NF-κB是炎症反应的主要调节因子,在各种生理和病理过程中都发挥了至关重要的作用,且NF-κB也成为治疗炎症相关性疾病的新的靶点。几乎所有NF-κB通路的诱导均需要IκB-kinase （IKK）的激活。IKKs由IKKα、β、γ三个亚基组成的复合物,其中起主要作用的是α和β亚基。在以前的研究中我们发现慢性肾衰脂肪组织中ERK1/2和JNK通路均活化增强,在本研究中我们探讨IKK信号通路在慢性肾衰脂肪组织中是否也活化增强。脂肪主要以甘油三脂的形式存储于脂肪细胞的脂滴内,脂肪细胞95%的内容物均是以TG作为核中心而形成的脂滴。近几年的研究结果发现在脂滴表面包被着一些特异性的蛋白,这些蛋白称为PAT蛋白家族,是脂滴降解过程的中心环节。PAT蛋白家族主要包括perilipinA、ADRP （adipose differentiation-related protein）和TIP47 （Tail-Interacting Protein of 47 kDa）。其中perilipinA蛋白是脂肪细胞内脂滴相关蛋白中表达最丰富的蛋白,同时也是脂肪细胞中的主要PKA位点。perilipinA被认为是调节脂肪细胞基础状态下脂解的主要因子。无论是脂肪细胞培养还是perilipinA-/-模型,大量研究表明perilipinA在调节脂肪细胞脂解中起了双重作用。在基础状态下,perilipinA包被在脂滴表面阻止胞浆内脂酶进入脂滴内,从而行使“门户”的功能减少甘油三脂分解,使甘油三脂处于极低基础分解状态下。Perilipin基因敲除小鼠体型较瘦,基础脂解率明显增强,这个实验结果更确定了perilipin可抑制脂肪组织基础脂解率的重要功能。在儿茶酚胺类等物质的刺激下,蛋白激酶A （PKA）和ERK1/2磷酸化perilipinA位点,磷酸化的perilipinA可促进脂酶聚集于脂滴内,促进脂解活动。ADRP是PAT蛋白家族中另一个主要成员,其N端与perilipin有高度同源性,其表达量与细胞内脂肪量密切相关。大量研究显示ADRP表达上调可增加脂滴内甘油三酯含量。与perilipinA功能相同,ADRP至少部分是通过降低甘油三脂分解率对胞内TAG和脂滴产生影响。TIP47与ADRP在氨基酸序列和三维结构上有高度同源性,可能在脂滴代谢的某些方面有同样的功能。有实验证明ADRP-/-小鼠显著降低了肝脏细胞内脂滴和内脂含量。ADRP和TIP47蛋白表达降低可增加FFA释放,促进对肾小管上皮细胞的毒性作用,但其分子机制仍不完全清楚。TIP47和ADRP基因敲除小鼠证明其脂肪组织脂解率较正常小鼠弱。因此可得出ADRP和TIP47脂滴表面蛋白表达下调同样可刺激脂肪细胞脂解增强。虽然我们已证实慢性肾衰大鼠脂肪组织脂质分解增强,但其潜在的机制目前仍不完全清楚,也无相关报道。因此,我们以5/6肾切除大鼠作为慢性肾衰模型,观察是否存在脂肪组织炎症增强及脂滴相关蛋白表达的变化,并探讨调节脂肪组织脂解IKKs信号通路活性。目的在于探讨慢性肾衰脂肪脂质分解增强的其他可能机制。研究方法一、二步法5/6肾切除建立慢性肾衰模型1.腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位固定于鼠台上。2.酒精消毒,于大鼠左腹部中1/3脊柱旁开2～3cm处行纵行切口,切口长度约为2～3cm。3.依次切开皮肤和皮下组织,并剪开肌肉暴露肾脏,剥离肾包膜,用无损伤血管钳夹住肾蒂,切除肾脏的上下极约占左肾的2/3,明胶海绵压紧上、下极创面止血,放松血管夹,观察创面不再渗血后还纳肾脏回腹腔,逐层缝合肌层及皮肤,酒精消毒手术切口。缝合前,腹腔内滴注青霉素注射液,预防感染。假手术组只作肾包膜剥离术。4.一周后,在脊柱右侧中1/3旁开2～3cm处行纵行切口（切口略高于左侧）,分离肌层,游离肾脏,无损伤血管夹夹住肾蒂,4号丝线结扎肾蒂,切除右侧肾脏,观察有无出血,缝合肌层和皮肤,酒精消毒手术切口。假手术组只作肾包膜剥离术。5.在整个手术完成后的第四、九、十六周大鼠眼眶后静脉采血测定血清肌酐,血尿素氮。二、标本的收集和处理将大鼠充分麻醉后固定于鼠板上,腹主动脉取血,4℃生理盐水灌注后取附睾处和腹膜后脂肪作为内脏脂肪的代表,从腹股沟切开取该处脂肪为皮下脂肪。EDTA-K2抗凝管收集血标本,30min内离心15分钟（4℃3000rpm）,留取血清,分装后-70℃冻存。取附睾和腹股沟处脂肪组织,脂肪的厚度不超过3mm,大小根据实际检材大小决定,通常为1cm2左右,置于10%中性甲醛固定液中固定。余下的脂肪组织保存于锡纸内,并-70℃冻存。三、留取血清用全自动生化分析仪检测血肌酐（SCr）、血尿素（BUN）浓度。四、血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1应用商品化ELISA试剂盒检测。五、脂肪总RNA的提取用Trizol提取法,逆转录PCR后用半定量和定量两种方法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、MAC-1、MIP-α、ED-1、PU.1因子mRNA表达。六、脂肪组织HE染色法观察脂肪组织有核细胞数量,免疫组化法标记脂肪组织巨噬细胞特异性抗体ED-1阳性细胞以及MAC-1阳性细胞。七、脂肪组织IKK通路（p-IKKα/χ、IKKα、IKKβ）、脂质过氧化产物（HNE）以及脂滴包被蛋白（perilipinA、ADRP、TIP47）用Western blotting方法来检测两组之间的不同表达。八、脂肪组织过氧化氢用商品化试剂盒检测,结果用蛋白浓度来纠正。九、统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。两个样本均数的比较采用Independent-Samples T Test, P<0.05为差异有统计学意义。结果一、肾衰大鼠模型的确立在二步法5/6肾切除手术建立大鼠肾衰模型后的第四、九、十六周采集大鼠血液测定大鼠肌酐,尿素氮水平,发现在第四周肾衰组的大鼠肌酐水平既有显著增高（P<0.05）。第九周、第十六周CRF组血甘油三酯水平（P<0.05）, BUN也显著增加（P<0.05）。在十六周时CRF组的体重比假手术组减轻（P<0.05）。二、5/6肾切除大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1表达上调。三、5/6肾切大鼠脂肪组织炎症反应增强脂肪组织炎症细胞浸润：我们将sham组和CRF组大鼠内脏和皮下脂肪组织固定行HE染色,结果显示CRF组单核细胞浸润内脏和皮下脂肪组织较sham组明显,有核细胞数明显增多。脂肪组织TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达：TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达定量分析得出,CRF组与sham组相比其mRNA表达水平提高。脂肪组织巨噬细胞浸润：脂肪组织免疫组化染色显示CRF组大鼠内脏和皮下脂肪组织ED-1、MAC-1阳性细胞数均较sham组的增多。脂肪组织巨噬细胞相关蛋白MCP-1、PU.1、MIP-1α、MAC-1、ED-1mRNA、的表达：定量PCR结果显示CRF组内脏和皮下脂肪较sham组相比,MCP-1、PU.1、MIP-1α、MAC-1、ED-1mRNA的表达上调四、脂肪组织IKKα/β的表达及其活性变化CRF组内脏和皮下脂肪组织IKKβ总蛋白表达较sham组增强,p-IKKα/β较sham组相比显著活化,IKKα总蛋白表达两组间无明显差异。五、肾衰大鼠脂肪组织氧化应激水平脂肪组织H202的含量：CRF组内脏和皮下脂肪组织H202的释放量较sham组相比增多。脂肪组织HNE蛋白的表达：作为脂质过氧化产物之一的HNE蛋白,与sham组相比,CRF组内脏和皮下脂肪HNE蛋白浓度表达增强。六、肾衰大鼠脂肪组织脂滴相关蛋白的表达CRF组内脏和皮下脂肪组织脂滴包被蛋白PerilipiA、ADRP、TIP47与sham组相比表达下调。结论1.慢性肾衰脂肪组织炎症因子、巨噬细胞浸润增加,氧化应激反应增强；2.与炎症相关的激酶IKKα/β显著活化；3.慢性肾衰脂肪组织脂滴包被蛋白表达下调。