抗戾饮对呼吸道冠状病毒感染模型影响的实验研究

论文摘要

传染性非典型肺炎,世界卫生组织命名为严重急性呼吸系统综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）,是一种由变异冠状病毒（SARS-associated coronavirus,SARS-CoV）感染引起的急性呼吸道传染性疾病,具有传染性强,病情重,进展快,危害大等流行病特点。对人生命健康和经济发展影响甚大。目前现代医学对SARS主要采用对症支持疗法,国内外也长期致力于抗病毒药物的研制及疫苗的开发。但是一项新的药物研发周期长,且病毒结构和入侵部位的特殊性,及病毒容易产生变异,使疫苗的研制难以跟上传染病不断变化和增多的现况。因此寻找有效的抗冠状病毒药物,是全世界和我国疾病防治中的重点。中医药防治病毒性传染病具有一定的优势,彭胜权教授根据既往治疗呼吸道病毒感染疾病的经验以及本次SARS发病特点,拟清热利湿、和胃化痰中药复方抗戾饮（蒿芩清胆汤合升降散化裁）治疗早中期SARS,临床疗效显著。实验室SARS模型建立存在很多的安全隐患,我们目前实验室的安全状况不能满足对SARS模型的研究。鸡传染性支气管炎病毒（IBV）与SARS-CoV同属冠状病毒属,是动物冠状病毒属中唯一可以引起呼吸道感染的病毒,最近研究也发现SARS-CoV与IBV亲缘关系较近,核苷酸序列有63%的同源性。尽管IBV能造成鸡只的急性呼吸道传染性疾病,但是它对工作人员及环境在一定实验室条件下并无任何威胁,因此我们考虑选用IBV替代SARS-CoV作为我们模拟呼吸道冠状病毒感染模型的建立。本项目正是基于以上背景而立题,试图建立安全的体内非SARS类呼吸道冠状病毒感染替代模型,从实验的角度客观评价中药复方制剂抗戾饮的作用环节,部分阐明其抗呼吸道冠状病毒感染的机制,为进一步推广应用提供科学依据。一抗戾饮体外抗呼吸道病毒实验研究目的:探讨抗戾饮对体外培养的三种呼吸道病毒RSV（呼吸道合胞病毒）、Ad3（腺病毒）、FM1（甲型流感病毒）治疗效果。方法:首先分别进行中药抗戾饮对MRC-5细胞株及MDCK细胞株的毒性测定。再进行抗戾饮在MRC-5细胞中抗RSV、Ad3活性的测定以及在MDCK细胞中抗FM1活性的测定。结果:抗戾饮对MRC-5细胞及MDCK细胞的半数毒性浓度(TC50)分别为7.62mg/ml,21.33mg/ml,最大无毒浓度（TC0）分别为5.50mg/ml、9.38mg/ml。抗戾饮对三种体外培养的病毒（RSV、Ad3、FM1）的半数抑制浓度(IC50)分别为>7.62mg/ml、>7.62mg/ml、>22mg/ml。抗戾饮对三种体外培养的病毒（RSV、Ad3、FM1）的治疗指数（TI）均<1。结论:抗戾饮对体外培养的MRC-5及细胞株的毒性较大,且对体外培养的三株呼吸道病毒(RSV、

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引言

SARS研究进展

一 SARS发病

二 SARS发病机制

1 呼吸系统损伤

2 免疫系统损伤

3 多脏器损伤

4 肺纤维化

三 SARS-CoV

1 SARS-CoV在冠状病毒属中的分类学地位

2 SARS-CoV的蛋白及其功能

（1） SARS-CoV编码的主要结构蛋白及其功能

（2） SARS-CoV编码的非结构蛋白及其功能

（3） SARS-CoV受体

四传染性非典型肺炎临床诊断标准（试行）

五卫生部：传染性非典型肺炎推荐治疗方案

六预后

七中医药对SARS认识

八疫苗研究以及中医药抗病毒优势

九中药抗戾饮的研究

十呼吸道冠状病毒体内模型研究

第一章抗戾饮体外抗呼吸道病毒实验研究

1 实验目的

2 实验材料

2.1 实验细胞

2.2 实验病毒株

2.3 实验试剂

2.4 实验仪器

2.5 实验用药

3 实验方法

3.1 细胞的培养

3.2 病毒传代

3.3 病毒滴度的测定

3.3.1 RSV、Ad3病毒的滴度测定

3.3.2 FM1病毒的滴度测定

3.4 药物细胞毒性作用的测定

3.4.1 实验药物对MRC-5细胞的毒性测定

3.4.2 实验药物对MDCK细胞的毒性测定

3.5 药物的抗病毒实验

3.5.1 药物在MRC-5细胞中抗RSV、Ad3活性的测定

3.5.2 药物在MDCK细胞中抗FM1活性的测定

50／IC₅₀'>3.6 治疗指数的计算：TI=TC₅₀／IC₅₀

4 实验结果

4.1 药物对两种细胞的毒性浓度（表1）

4.2 药物对病毒的半数抑制浓度（表2）

4.3 药物的治疗指数（表3）

5 结论

6 附图（见论文后附图1～11）

第二章抗戾饮对呼吸道冠状病毒体内感染模型的影响

第一节呼吸道冠状病毒——IBV的增殖与鉴定

前言

1 实验材料

1.1 病毒

1.2 实验鸡胚

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2 实验方法

2.1 病毒的增殖

2.2 致鸡胚矮小化实验

2.3 对新城疫病毒B1株（NDV-B1）干扰实验

2.4 IBV基因组N基因的RT-PCR鉴定

2.4.1 引物设计与合成

2.4.2 病毒总RNA的抽提

2.4.3 cDNA合成（RT）

2.4.4 N基因目的片断的PCR扩增

3 实验结果

3.1 病毒的增殖

3.2 致鸡胚矮化实验

3.3 对NDV-B1株的干扰实验

3.4 IBV基因组N基因的RT-PCR鉴定结果

4 讨论

5 结论

第二节呼吸道冠状病毒——IBV感染雏鸡模型研究

前言

1 实验材料

1.1 病毒

1.2 实验用动物

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2 实验方法

2.1 人工致鸡感染鸡传染性支气管炎病毒模型建立

2.2 观测指标

2.2.1 一般观察及体重、肛温检测

2.2.2 呼吸道症状观察与评分

2.2.3 病理组织学检测

2.2.4 鸡组织IBV RT-PCR检测

3 实验结果

3.1 一般情况与体重及体温的变化

3.2 呼吸道症状观察与评分

3.3 病理组织学检测

3.4 IBV N基因的RT-PCR鉴定结果

4 讨论

5 结论

第三节抗戾饮对人工致雏鸡感染呼吸道冠状病毒的影响研究

前言

1 材料及造模方法

1.1 药物

1.2 毒种及实验用动物

1.3 主要实验试剂

1.4 主要仪器

1.5 病毒模型制造、分组及给药

2 实验一抗戾饮对人工致雏鸡感染IBV模型组织N基因相对表达量的影响

2.1 实验方法

2.1.1 造模、分组及给药方法：

2.1.2 实验观察及指标

2.1.3 鸡组织IBV病毒实时荧光定量PCR测定

2.2 结果与分析

2.2.1 Real-time PCR引物设计

2.2.2 Real-time PCR循环参数的优化

2.2.3 Real-time PCR读板温度的优化

2.2.4 Real-time PCR重复性检测

2.2.5 Real-time PCR标准曲线的构建与样本IBV N基因相对表达量的测定

2.2.6 病理组织学检测

3 实验二抗戾饮对人工致鸡感染雏鸡IBV模型的保护作用

3.1 实验方法

3.1.1 造模、分组及给药方法

3.1.2 实验观察

3.1.3 统计学处理

3.2 结果与分析

3.2.1 一般观察

3.2.2 发病率、死亡率、及死亡保护率结果

3.2.3 体温变化结果

4 实验三抗戾饮对人工致雏鸡感染IBV模型抗体形成的作用

4.1 实验方法

4.1.1 造模、分组及给药方法

4.1.2 样本收集

4.1.3 IBV抗体检测方法

4.1.4 统计学处理

4.2 结果及分析

5 实验四抗戾饮对雏鸡的急性毒性实验

5.1 实验材料

5.1.1 药物

5.1.2 动物

5.2 实验方法

5.3 实验结果及分析

6 讨论

7 结论

第三章结语

1 已达到的目标

1.1 体外抗病毒实验

1.2 体内抗病毒实验

2 本课题的特点和创新性

3 本课题的不足之处

4 在读期间参与课题

5 在读期间发表的论文情况

6 获奖情况

文献综述一实时荧光定量PCR的研究进展及应用

1 实时荧光定量PCR的原理

1.1 荧光域值（threshold）的设定

1.2 Ct值与起始模板的关系

1.3 实时定量PCR的荧光模式

2 实时荧光定量PCR的定量方法

3 实时荧光定量PCR引物和探针设计要求

4 实时荧光定量PCR的优点与局限性

5 实时荧光定量PCR的应用

6 展望

文献综述二鸡传染性支气管炎（IB）研究进展

1 IB概述

2 IBV的分子结构

2.1 基因组结构

2.2 病毒蛋白组成

2.2.1 纤突（S）蛋白

2.2.2 膜（M）蛋白

2.2.3 核衣壳（N）蛋白

3 IB诊断方法

4 IBV发病与临床诱因

参考文献

附图

致谢

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