微波辅助嗜热菌蛋白酶的固定化及其在阿斯巴甜前体合成中的应用

论文摘要

阿斯巴甜是一个二肽甜味剂,其甜度是蔗糖的200倍,味如白糖,不腻不苦,低热量可减肥,适合于肥胖症、心血管疾病、糖尿病等病人使用。目前低碳高效的合成阿斯巴甜前体的方法是嗜热菌蛋白酶催化法。但传统的酶催化合成阿斯巴甜前体过程中存在反应时间长、酶的回收利用率低、产物分离纯化困难、产率低等问题。本论文采用了一种氯化钠增溶及微波辅助的方法快速高效地制备了固定化嗜热菌蛋白酶,并且引进了小分子封闭的技术,提高了固定化酶的稳定性。将所得固定化酶应用于阿斯巴甜前体的合成中,不但提高了反应产率而且缩短了反应时间,提高了酶的回收利用率,简化了产物的分离纯化工作。本论文的主要内容及结论分为以下几个方面：（1）在固定化过程中加入3MNaCl提高嗜热菌蛋白酶的溶解性,用40W的微波对反应进行辐射使得固定化的负载率为93.2%；固定化酶的催化活力为17925.1U/mg,是常规固定化酶的4.5倍,是游离酶的1.6倍。固定化时间也从20h缩短到了3min,大约缩短了399倍。而且固定化提高了嗜热菌蛋白酶的热稳定性和耐有机溶剂的性能并且使酶能够回收利用,极大节约生产成本。（2）在固定化过程中,载体的表面存在多余的活性基团影响固定化酶的稳定性。因此本文加入小分子物质封闭载体表面的多余基团,阻止其对固定化酶的迫害。丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、叔戊醇等小分子都大大提高了固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性。（3）在水相中以天然的嗜热菌蛋白酶为催化剂,Z-Asp-OH、Phe-OMe.HCl为底物,40W功率的微波辐射,30℃下反应10min,产物ZAPM的产率为60.91%,比常规反应高出了9个百分点。而反应时间从6h缩短到了10min,大约缩短了35倍。（4）在乙酸乙酯-水双相系统中,微波固定化酶在氯化钙和氯化钠的协助下催化合成ZAPM,使得产率达到了28.3%,单位酶量单位时间内合成的ZAPM单位量达到了0.475/h,是Takeshi Nagayasu等人曾经报道的19倍。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 前言
• 1.1 阿斯巴甜
• 1.1.1 阿斯巴甜简介
• 1.1.2 阿斯巴甜的历史及其发展前景
• 1.1.3 阿斯巴甜的合成方法
• 1.1.3.1 化学合成法
• 1.1.3.2 生物合成法
• 1.2 酶的固定化
• 1.2.1 酶固定化概念
• 1.2.2 固定化载体的种类
• 1.2.2.1 合成的有机聚合物
• 1.2.2.2 生物高聚物
• 1.2.2.3 无机载体
• 1.2.3 酶固定化方法
• 1.3 微波在生物催化中的应用
• 1.3.1 微波简介
• 1.3.2 微波的作用机制
• 1.3.3 微波在酶固定化中的应用
• 1.3.4 微波在酶催化反应中的应用
• 1.4 本课题的目的、意义及内容
• 1.4.1 课题的目的、意义
• 1.4.2 课题的研究内容
• 第二章 嗜热菌蛋白酶的固定化
• 2.1 引言
• 2.2 实验
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验步骤
• 2.3.1 功能化介孔泡沫硅载体（MCFs-NH2）的制备
• 2.3.2 环氧化介孔泡沫硅载体的制备
• 2.3.3 载体的活化
• 2.3.4 嗜热菌蛋白酶的固定化
• 2.3.4.1 微波辅助的嗜热菌蛋白酶的固定化
• 2.3.4.2 常规条件下的嗜热菌蛋白酶的固定化
• 2.3.5 酶活测定方法的建立
• 2.3.5.1 酪氨酸标准曲线的绘制
• 2.3.5.2 酶活测定方法
• 2.3.6 嗜热菌蛋白酶催化水解ZAPM的动力学研究
• 2.3.6.1 ZAPM标准曲线的绘制
• 2.3.6.2 实验方法
• 2.3.7 酶的热稳定性研究
• 2.3.7.1 酶在水中的热稳定性研究
• 2.3.7.2 酶在有机溶剂中的热稳定性研究
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 酶活测试方法建立
• 2.4.2 交联剂种类对固定化嗜热菌蛋白酶活力的影响
• 2.4.3 对苯醌浓度对载体MCFs-NH2固定嗜热菌蛋白酶的影响
• 2.4.4 中性盐对固定化嗜热菌蛋白酶催化活性的影响
• 2.4.5 嗜热菌蛋白酶常规固定化和微波固定化的比较
• 2.4.6 加酶量对固定嗜热菌蛋白酶的影响
• 2.4.7 微波辐射功率对固定嗜热菌蛋白酶的影响
• 2.4.8 嗜热菌蛋白酶催化水解ZAPM的动力学研究
• 2.4.8.1 ZAPM的标准曲线的绘制
• 2.4.8.2 嗜热菌蛋白酶催化水解ZAPM的动力学实验
• 2.4.9 嗜热菌蛋白酶自由酶、微波固定化嗜热菌蛋白酶性能比较
• 2.5 本章小结
• 第三章 小分子封闭提高固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性
• 3.1 引言
• 3.2 实验
• 3.2.1 实验材料与仪器
• 3.2.1.1 实验材料
• 3.2.1.2 实验仪器
• 3.3 实验步骤
• 3.3.1 载体的制备
• 3.3.2 载体的活化
• 3.3.3 嗜热菌蛋白酶的固定化
• 3.3.4 小分子封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性影响的研究
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 小分子封闭的原理
• 3.4.2 胺类封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响
• 3.4.3 二元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响
• 3.4.4 一元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响
• 3.4.5 芳香族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性影响
• 3.4.6 脂肪族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性影响
• 3.5 本章小结
• 第四章 微波辅助酶促合成阿斯巴甜前体
• 4.1 引言
• 4.2 实验
• 4.2.1 实验材料与仪器
• 4.2.1.1 实验材料
• 4.2.1.2 实验仪器
• 4.2.2 水相中嗜热菌蛋白酶催化合成阿斯巴甜前体实验
• 4.2.2.1 阿斯巴甜前体（ZAPM）标准曲线的绘制
• 4.2.2.2 水相中微波辅助酶促合成阿斯巴甜前体
• 4.2.2.3 水相中常规条件下酶促合成阿斯巴甜前体
• 4.2.3 有机-水双相系统中固定化酶催化合成阿斯巴甜前体
• 4.2.3.1 ZAPM标准曲线的绘制
• 4.2.3.2 有机溶剂的选择（分配系数的测定）
• 4.2.3.3 双相系统中微波固定化酶催化合成阿斯巴甜前体
• 4.2.3.4 双相系统中常规固定化酶催化合成阿斯巴甜前体
• 4.2.4 数据处理
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 微波反应系统的介绍
• 4.3.2 水相中酶促合成阿斯巴甜前体实验结果与讨论
• 4.3.2.1 阿斯巴甜前体（ZAPM）标准曲线的绘制
• 4.3.2.2 常规条件下与微波条件下反应产率的对比
• 4.3.2.3 温度对嗜热菌蛋白酶催化合成ZAPM的影响
• 4.3.2.4 微波辐射功率对嗜热菌蛋白酶催化合成ZAPM的影响
• 4.3.3 双相系统中固定化酶催化合成阿斯巴甜前体实验结果与讨论
• 4.3.3.1 ZAPM标准曲线的绘制
• 4.3.3.2 有机溶剂的选择（分配系数的测定）
• 4.3.3.3 微波固定化酶与常规固定化酶催化合成ZAPM产率对比
• 4.3.3.4 温度对微波固定化酶催化合成ZAPM产率的影响
• 4.3.3.5 时间对微波固定化酶催化合成ZAPM产率的影响
• 4.3.3.6 中性盐对微波固定化酶催化合成ZAPM产率的影响
• 4.4 本章小结
• 4.4.1 水相中嗜热菌蛋白酶催化合成阿斯巴甜前体的小结
• 4.4.2 双相系统中固定化酶催化合成阿斯巴甜前体小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间主要科研成果