弓形虫模拟肽的筛选及应用研究

论文摘要

弓形虫是一种全球性分布的寄生原虫,可感染鸟类、哺乳动物和人。人感染弓形虫之后一般表现为隐性,但孕妇感染弓形虫常会流产或者胎儿发育不全。此外感染了弓形虫的人在免疫力低下时易诱发多种疾病。弓形虫病是导致艾滋病患者死亡的元凶之一。弓形虫还是畜牧业的重大危害之一。目前弓形虫的诊断和防治仍有待完善,新型弓形虫疫苗的研制是目前研究的重点。 本课题采用噬菌体随机肽库筛选弓形虫抗原的模拟表位。我们用纯化的兔感染弓形虫血清作“诱饵”,从12肽和环7肽噬菌体随机肽库中分别筛选与该多抗有特异性结合的噬菌体,经过三轮正向筛选和正常血清反向吸收,将噬菌体单克隆化。ELISA结果显示,三轮筛选噬菌体得到了较有效的富集,并且亲和力逐轮提高。竞争ELISA显示第三轮筛选的噬菌体能抑制天然弓形虫抗原与兔感染弓形虫血清反应。噬菌体单克隆分别和多个阳性血清、正常兔血清反应,获得阳性克隆35个（25个12肽,10个环7肽）。和其他寄生虫血清无交叉反应。阳性单克隆DNA测序结果显示有25个克隆（19个12肽,6个环7肽）具有“WH:/WHH”或“W×H”的基序,13个克隆（12肽）具有SP/S×P的基序。通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov与天然弓形虫抗原的基因序列比对,发现这些克隆与弓形虫重要的保护性抗原,如表膜抗原、致密颗粒抗原、棒状体蛋白、外分泌抗原等具有同源序列。根据ELISA和序列比对结果选择10个（6个12肽,4个环7肽）克隆进行Western Blottin、dot-ELISA检测和免疫小鼠,结果显示阳性克隆能特异地和兔感染弓形虫血清反应,在约66kD处有一特异的条带,能够诱导小鼠产生和天然弓形虫抗原反应的抗体,诱导小鼠产生保护性免疫应答,与对照组相比明显延长了攻击弓形虫后的小鼠的存活时间。 通过本课题研究,我们筛选到了能与弓形虫抗体特异性结合的噬菌体克隆,而且这些克隆无论在ELISA、Western Blotting等方法的鉴定中还是在动物试验上,都显示了它们能够模拟天然弓形虫抗原,而序列分析又为这个结论提供了基因水平的证据。我们推断这些克隆有可能发展成新的具有良好特异性的弓形虫检测原,也为弓形虫新型疫苗的研究打下了基础,提示噬菌体模拟肽可用于新型疫苗的研制。

论文目录

• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢