人脐带间充质干细胞旁分泌物质治疗暴发性肝衰竭的实验研究

论文摘要

目的探索人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs）旁分泌物质对实验性暴发性肝衰竭大鼠的治疗作用,并研究其对大鼠肝细胞增殖和凋亡的影响。方法体外分离培养人脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测UC-MSCs的表面标志,制备含有UC-MSCs旁分泌物质的条件培养基（MSC-CM）,腹腔注射D-氨基半乳糖制备暴发性肝衰竭大鼠模型。实验分组：MSC-CM组、生理盐水（NS）组和促肝细胞生长素（PHGF）组,在模型制备后24h从大鼠尾静脉分别注射三组治疗药物。每组8只大鼠治疗后12h、24h、36h、60h分别内眦取血测定谷丙转氨酶（ALT）和总胆红素（TBIL）的含量。每组另取5只大鼠在治疗后36h取肝脏组织制备切片进行HE染色、PCNA免疫组织化学染色以及TUNEL染色,检测大鼠肝组织中炎性细胞浸润情况以及肝细胞增殖和凋亡的情况。并在无菌条件下取大鼠肝组织-80℃冷藏,提取RNA, RT-PCR法检测大鼠肝组织由HGF、EGF、HB-EGF、TNF-a、OSM等基因的表达情况。同时取大鼠外周血,ELISA法检测大鼠血清中细胞因子TNF-a和IL-10的含量。剩余每组10只大鼠治疗后密切观察并记录生存状态及生存时间,进行生存分析。结果1.胶原酶及胰酶两步法可有效消化脐带,使脐带间充质干细胞易于分离获得,收集细胞后进行原代培养,24小时后光镜下可观察到贴壁细胞,其形态为长梭形、不规则形,细胞大小不一,类似成纤维细胞,呈漩涡样生长。流式细胞仪检测发现,细胞高表达CD29、CD49、CD90、CD105及HLA-I,低表达造血细胞表型CD34、CD45及内皮细胞表型CD31,低表达CD14、HLA-DR。2.大鼠血清中ALT及TBIL含量检测发现,MSC-CM组及PHGF组大鼠治疗后24h ALT及TBIL的含量均低于NS组（P<0.05）,而MSC-CM组与PHGF组比较差异无统计学意义。3.ELISA法检测发现,MSC-CM组与PHGF组大鼠血清中TNF-a含量均低于NS组（P<0.05）,而IL-10含量均高于NS组（P<0.05）,MSC-CM组与PHGF组比较大鼠血清中TNF-a及IL-10含量无统计学差异。4.大鼠治疗后36h肝脏切片PCNA染色显示,MSC-CM组与PHGF组中PCNA阳性肝细胞数均高于NS组（P<0.01）, MSC-CM组与PHGF组比较差异无统计学意义。TUNEL染色显示,MSC-CM组与PHGF组中TUNEL阳性肝细胞数均低于NS组（P<0.05）, MSC-CM组与PHGF组比较差异无统计学意义。5.RT-PCR检测发现,MSC-CM组与PHGF组大鼠肝组织中5个基因的表达与NS组大鼠相比大约升高2-4倍（P<0.05）, MSC-CM组与PHGF组比较差异无统计学意义。6.三组大鼠进行生存分析发现,MSC-CM组与PHGF组大鼠的生存率均高于NS组（P<0.05）,而MSC-CM组与PHGF组比较差异无统计学意义。结论经酶消化法可从脐带中获得大量细胞,细胞增殖能力强,扩增迅速,其形态及免疫表型与骨髓间充质干细胞相一致,符合间充质干细胞的生物学特性,为进一步实验提供可靠的细胞来源。人脐带间充质干细胞的旁分泌物质可以刺激暴发性肝衰竭大鼠肝细胞再生,抑制肝细胞凋亡,改善大鼠的肝功能,提高暴发性肝衰竭大鼠生存率,为暴发性肝衰竭的治疗提供了一种新途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 研究对象
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 主要溶液
• 1.1.5 脐带间充质干细胞的分离、接种与培养
• 1.1.6 流式细胞仪检测细胞表面标志
• 1.1.7 统计学方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 UC-MSCs体外生长情况及形态学观察
• 1.2.2 UC-MSCs免疫表型鉴定
• 1.3 讨论
• 1.3.1 脐带间充质干细胞
• 1.3.2 脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定
• 1.3.3 UC-MSCs与BM-MSCs生物学特性比较
• 1.3.4 脐带间充质干细胞的优势
• 1.4 小结
• 二、人脐带间充质干细胞旁分泌物质治疗暴发性肝衰竭的实验研究
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 研究对象
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要溶液
• 2.1.5 暴发性肝衰竭（FHF）大鼠的制备
• 2.1.6 暴发性肝衰竭（FHF）大鼠的治疗
• 2.1.7 ELISA法检测大鼠血清中细胞因子表达情况
• 2.1.8 大鼠肝组织苏木素-伊红（HE）染色
• 2.1.9 大鼠肝组织增殖细胞核抗原（PCNA）染色
• 2.1.10 大鼠肝组织TUNEL染色
• 2.1.11 RT-PCR检测大鼠肝组织中基因表达情况
• 2.1.12 统计学方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 FHF大鼠肝脏组织病理观察
• 2.2.2 脐带MSC-CM对FHF大鼠肝功能的影响
• 2.2.3 FHF大鼠血清中细胞因子检测结果
• 2.2.4 FHF大鼠肝脏病理改变
• 2.2.5 FHF大鼠肝脏PCNA染色结果
• 2.2.6 FHF大鼠肝脏TUNEL染色结果
• 2.2.7 各组FHF大鼠基因表达结果
• 2.2.8 三组大鼠生存分析结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 D-GalN致大鼠FHF的原理
• 2.3.2 脐带间充质干细胞旁分泌物质
• 2.3.3 MSC-CM对FHF大鼠肝功能的修复
• 2.3.4 MSC-CM对FHF大鼠血清中细胞因子的影响
• 2.3.5 MSC-CM对FHF大鼠肝组织病理改变情况
• 2.3.6 MSC-CM对FHF大鼠肝细胞再生的影响
• 2.3.7 MSC-CM对FHF大鼠肝细胞凋亡的影响
• 2.3.8 促肝细胞生长素（PHGF）
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 人脐带间充质干细胞旁分泌物质的作用及对肝功能衰竭的影响
• 综述参考文献
• 致谢