志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体的制备

论文摘要

仔猪水肿病是由产Vero细胞毒素大肠杆菌（VTEC）引起的急性致死性传染病,该病发病急、死亡快,往往来不及治疗,死亡率很高。能引起断奶仔猪四肢麻痹、步态蹒跚、痉挛和昏迷等神经症状。剖检可见胃壁和肠系膜水肿,因此称之为“水肿病”。研究证明,该病的发生与产Vero细胞毒素大肠杆菌的两个致病因子——F18ab（F107）菌毛与志贺样毒素Ⅱ型变异体（Shiga-like ToxinⅡvariant,SLT-Ⅱe）密切相关,其中SLT-Ⅱe起主要的毒力作用。本研究应用PCR技术扩增了SLT-Ⅱe B基因,经序列测定,结果与参考序列的同源性达100%。将PCR产物克隆到原核表达载体pET-30a中,转化入大肠杆菌BL21（DE3）并用IPTG诱导表达。通过Ni离子亲和层析纯化融合表达的SLT-Ⅱe B蛋白,以此作为免疫原免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术将小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,经间接ELISA检测和四次亚克隆,获得6株阳性杂交瘤细胞,分别命名为2B10、3A8、3C11、3D7、3G7和4F3。经单克隆抗体亚类试剂盒鉴定,6株单克隆抗体的亚类包括IgG2a、IgG2b、IgA和IgM,且均为κ轻链。经杂交瘤细胞染色体数目分析,6株杂交瘤细胞的平均染色体数是90～115,明显多于SP2/0骨髓瘤细胞数（55～65）。ELISA检测结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清液的效价分别为1:128～1:512。以两株分泌IgG类单克隆抗体的杂交瘤细胞（3G7、4F3）制备的腹水,效价均为1:105。阻断ELISA结果显示,6株单克隆抗体均与天然毒素（SLT-Ⅱe）有良好的反应性,且不与天然毒素LT、ST反应。通过相加ELISA测定可知,3G7和4F3两株单克隆抗体是针对不同抗原表位的单抗。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 仔猪水肿病的概述
• 1.2 仔猪水肿病的主要致病因子
• 1.2.1 志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）
• 1.2.2 定居因子F18ab（F107）菌毛
• 1.2.3 致病机理
• 1.3 仔猪水肿病的诊断方法
• 1.3.1 流行病学特点
• 1.3.2 临床症状和剖检病变
• 1.3.3 实验室诊断
• 1.3.4 应用单克隆抗体的检测方法研究进展
• 1.4 仔猪水肿病的预防
• 1.5 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒、菌株、实验动物和细胞系
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 PCR扩增引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SLT-Ⅱe B基因的克隆、表达及纯化
• 2.2.2 单克隆抗体的制备
• 2.2.3 杂交瘤细胞的鉴定
• 2.2.4 单克隆抗体的鉴定
• 3 结果
• 3.1 SLT-Ⅱe B基因的克隆、表达及纯化
• 3.1.1 SLT-Ⅱe B基因克隆载体的鉴定
• 3.1.2 SLT-Ⅱe B基因表达载体的鉴定
• 3.1.3 重组质粒的表达及纯化
• 3.1.4 Western blot鉴定
• 3.2 细胞融合与筛选
• 3.2.1 ELISA筛选方法建立
• 3.2.2 细胞融合率
• 3.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 3.3 杂交瘤细胞鉴定
• 3.3.1 杂交瘤染色体数目分析
• 3.3.2 杂交瘤分秘抗体稳定性鉴定
• 3.4 单克隆抗体鉴定
• 3.4.1 单克隆抗体亚类鉴定
• 3.4.2 杂交瘤细胞培养上清效价测定
• 3.4.3 腹水单抗效价测定
• 3.4.4 抗原表位分析
• 3.4.5 单克隆抗体免疫活性鉴定
• 3.4.6 单克隆抗体特异性鉴定
• 4 讨论
• 4.1 免疫原的选择
• 4.2 单克隆抗体与天然SLT-IIe反应性的检测
• 4.3 单克隆抗体的临床应用
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文