陕西省苹果轮纹病菌及其遗传多样性的研究

论文摘要

苹果轮纹病可同时危害苹果树的枝干和果实,是世界上影响苹果生产的重要病害之一,在我国的各大苹果产区均有发生。据本实验室连续3年的调查,陕西省苹果轮纹病的发病率较高,平均病株率可达60%,给陕西省的苹果生产带来了严重的损失。然而到目前为止,陕西省苹果轮纹病菌的种类及起源还不甚明确,并且未见较大样本的分子遗传多样性分析,这在一定程度上制约了该病害流行规律及防治方法等的研究进程。本研究采用SRAP分子标记及ISJ分子标记对来源于陕西省的276株轮纹病菌株及山西、山东、河南和四川等四省的70株苹果轮纹病菌株的遗传多样性进行研究,同时对其中的119株进行了rDNA-ITS序列分析,主要得到如下结果:1. rDNA-ITS序列比对分析表明约95%的供试菌株与GenBank数据库中来源于苹果、槐树及木瓜的Botryosphaeria dothidea序列相似性为99%以上,说明B. dothidea为陕西省苹果轮纹病菌的优势种类。2.建立了适用于苹果轮纹病菌的SRAP-PCR反应体系:10 mM的dNTPs,0.5μL;10×Taq Buffer,2.5μL;10μM的正向引物,1.0μL;10μM的反向引物,1.0μL;25 mM的氯化镁,2.0μL;5 U/μL的Taq聚合酶,0.15μL;200 ng/μL的DNA模板,1.0μL;灭菌超纯水,17.3μL。按上述体系对供试菌株进行PCR扩增,根据所得电泳图谱构建0,1矩阵并对所得数据进行聚类分析。结果显示,6对引物共得到多态性条带53条,占总条带的89.83%,说明苹果轮纹病菌种群内部存在着丰富的SRAP多态性。聚类分析显示在相似系数为0.705水平时,272株供试菌株被分为7个类群。同一地理来源的菌株分散在两个以上的类群中,而在同一聚类组内同时存在不同地理来源的苹果轮纹菌菌株,结果表明陕西省的苹果轮纹病菌存在丰富的遗传多样性,且与其地理来源无显著相关性。3.建立了适用于苹果轮纹病菌的ISJ-PCR反应体系:10 mM的dNTPs,0.5μL;10×Taq Buffer,2.5μL;25 mM的氯化镁,2.5μL;10μM的引物,0.75μL; 5 U/μL的Taq聚合酶,0.13μL;200 ng/μL的DNA模板,1.0μL;灭菌超纯水,16.87μL。按上述体系对供试菌株进行PCR扩增,根据所得电泳图谱构建0,1矩阵并对所得数据进行聚类分析。结果显示4条引物共得到多态性条带34条,占总条带的82.93%,说明苹果轮纹病菌种群内部存在着丰富的ISJ多态性。聚类分析显示在相似系数为0.67水平时,272株供试菌株被分为3个类群,其中类群Ⅱ有可细分为两个亚类。分析结果与SRAP标记的分析结果基本一致,即陕西省的苹果轮纹病菌存在丰富的遗传多样性,且与其地理来源无显著相关性。4.以上两点表明SRAP标记技术及ISJ标记技术均可以用于苹果轮纹病菌群体遗传结构分析,其结果稳定、可靠。5.使用ISJ引物B1对供试菌株基因组DNA进行PCR扩增时发现,B. dothidea和B. obtusa具有约500bp的特征性条带;而B. obtusa还具有一条550bp的特征性条带,因此引物B1的扩增结果可以作为B. dothidea和B. obtusa划分的分子依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 我国苹果轮纹病的发生及危害情况
• 1.2 苹果轮纹病菌的种类研究
• 1.3 苹果轮纹病菌的致病性分化研究
• 1.4 rDNA-ITS 序列分析及其在真菌中的应用
• 1.5 分子标记技术的概念及常用种类
• 1.6 SRAP 标记技术简介
• 1.7 ISJ 标记技术简介
• 1.8 本研究的目的、意义
• 第二章 苹果轮纹病菌rDNA-ITS 序列分析
• 2.1 试验材料和方法
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 基因组DNA 的提取
• 2.2.2 rDNA-ITS 的PCR 扩增结果
• 2.2.3 供试菌株rDNA-ITS 片段序列分析
• 2.2.4 rDNA-ITS 序列系统发育分析
• 2.3 结论与讨论
• 2.3.1 陕西省苹果轮纹病的优势致病种类为Botryosphaeria dothidea
• 2.3.2 rDNA-ITS 序列分析显示供试菌株中存在其他种类
• 2.3.3 rDNA-ITS 序列分析显示B. dothidea 种内在核苷酸序列上存在分化
• 第三章 苹果轮纹病菌遗传多样性的SRAP 标记分析
• 3.1 试验材料和方法
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 SRAP-PCR 引物的筛选
• 3.2.2 苹果轮纹病菌SRAP-PCR 反应体系及程序的优化
• 3.2.3 SRAP-PCR 的扩增结果
• 3.2.4 陕西省苹果轮纹病菌的SRAP 标记分析
• 3.2.5 陕西省苹果轮纹病菌遗传多样性与致病性分化相关性分析
• 3.3 结论与讨论
• 3.3.1 建立了适用于苹果轮纹病菌的SRAP-PCR 体系
• 3.3.2 苹果轮纹病菌种内遗传多样性丰富，但与地理来源无明显相关性
• 3.3.3 苹果轮纹病菌种内遗传多样性与致病性等无明显相关性
• 第四章 苹果轮纹病菌遗传多样性的ISJ 标记分析
• 4.1 试验材料和方法
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 ISJ-PCR 引物的筛选
• 4.2.2 ISJ-PCR 体系及程序的优化结果
• 4.2.3 ISJ-PCR 扩增结果
• 4.2.4 陕西省苹果轮纹病菌的ISJ 标记分析
• 4.2.5 我国部分省份苹果轮纹病菌的遗传多样性分析
• 4.2.6 利用ISJ 引物B1 可区分Botryosphaeria dothidea 和B. obtusa 两个种
• 4.3 结论与讨论
• 4.3.1 建立了适用于苹果轮纹病菌的ISJ-PCR 体系
• 4.3.2 苹果轮纹病菌种内遗传多样性丰富，但与地理来源无明显相关性
• 4.3.3 引物B1 可以作为区分B. dothidea 和B. obtusa 两个种的特异性引物
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录一 苹果轮纹病菌及其采集信息
• 附录二 研究中所用引物序列
• 附录三 SRAP-PCR 扩增产物电泳图谱
• 附录四 陕西省苹果轮纹病菌SRAP 聚类分析图
• 附录五 ISJ-PCR 产物电泳图谱
• 附录六 陕西省苹果轮纹病菌ISJ 聚类分析图
• 附录七 我国部分省份苹果轮纹病菌的ISJ 聚类分析图
• 致谢
• 作者简介