腺相关病毒/sTNFRⅡ:Fc基因治疗类风湿关节炎的研究

论文题目: 腺相关病毒/sTNFRⅡ:Fc基因治疗类风湿关节炎的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 高凯

导师: 王军志,吴小兵,张英起

关键词: 类风湿关节炎,基因治疗,自身免疫疾病,腺相关病毒,腺相关病毒载体血清型,段融合蛋白,肿瘤坏死因子

文献来源: 第四军医大学

发表年度: 2005

论文摘要: 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性自身免疫疾病,虽然对RA的致病机理目前还不十分清楚,但均公认细胞因子网络参与介导了整个病理过程。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)是巨噬细胞/单核细胞活化后产生的一种多功能细胞因子,同时也是重要的炎症因子,与包括类风湿关节炎在内的众多自身免疫疾病密切相关。近年来以生物技术手段通过阻断TNFα与受体的信号传导已经可以使类风湿关节炎临床症状得到缓解改善,但这些蛋白药物均为系统给药,剂量大成本高,而基因治疗则具有诸如在体内长期表达治疗基因,给药间隔长、局部给药可提高病灶治疗药物浓度等一些相对优势,并成为具有应用前景的类风湿关节炎新型生物技术治疗手段之一。 腺相关病毒载体(adeno-associated virus,AAV)由于可介导外源基因的长期表达、免疫原性弱、宿主范围广等特点是基因治疗中具有优势前景的载体之一。因外壳蛋白的不同而导致各血清型腺相关病毒载体在不同组织具有感染效率和表达量的差异,近年来相关研究十分活跃。 本研究构建了分别携带人或大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因(sTNFR:Fc)的1、2型重组腺相关病毒(AAV1,AAV2),在对所构建的重组病毒序列和载体理化指标进行确证分析后,首先于体外对其表达能力和TNFα中和活性进行了研究。结果表明所构建的重组腺相关病

论文目录:

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾一：类风湿关节炎治疗及相关研究进展

文献回顾二：不同血清型腺相关病毒载体研究进展

实验流程示意图

腺相关病毒载体载体生产原理示意图

正文

第一部分 携带人或大鼠肿瘤坏死因子受体：Fc基因重组腺相关病毒的构建

一、实验材料

1.生化试剂

2.工具酶、试剂盒等

3.质粒、菌株和细胞

4.主要仪器设备

二、实验方法

1.重组载体质粒pSNAV-1／human sTNFRⅡ：Fc的构建

1.1 人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区基因扩增

1.2 人IgG1 Fc段基因的扩增

1.3 人TNFR：Fc融合基因的连接及克隆

2.重组载体质粒pSNAV-1／rat sTNFRⅡ：Fc的构建

2.1 大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区基因扩增

2.2 大鼠IgG1 Fc段基因的扩增

2.3 大鼠TNFR：Fc融合基因的连接及克隆

3.稳定携带pSNAV1-hTNFR：Fc或pSNAV1-rat TNFR：Fc质粒载体细胞株的建立

4.携带人或大鼠肿瘤坏死因子受体：Fc融合基因的重组腺相关病毒的大规模制备

5.携带人或大鼠肿瘤坏死因子受体：Fc融合基因的重组腺相关病毒的质量控制

5.1 AAV载体本身的结构确认

5.2 病毒颗粒纯度

5.3 病毒滴度测定

5.4 重组腺相关病毒的电镜分析

三、实验结果

1.重组载体质粒pSNAV1-hTNFR：Fc的构建

2.重组载体质粒pSNAV1-ratTNFR：Fc的构建

3.重组腺相关病毒的质量控制结果

3.1 重组腺相关病毒外壳蛋白分子量及纯度测定

3.2 离子交换色谱测定重组腺相关病毒颗粒纯度

3.3 重组腺相关病毒颗粒数(滴度)测定

3.4 重组腺相关病毒的电镜分析

四、讨论

五、小结

参考文献

第二部分 重组腺相关病毒载体介导外源基因于体外和体内的表达研究

一、实验材料

1.试剂

2.细胞株

3.实验动物

4.主要仪器设备

二、实验方法

1.重组腺相关病毒体外表达及TNFα中和活性研究

1.1 重组腺相关病毒的体外表达

1.2 不同血清型重组腺相关病毒的生物学活性研究

2.不同血清型重组腺相关病毒体内表达

2.1 携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的腺相关病毒于大鼠体内表达

2.1.1 肌肉单次给药表达

2.1.2 膝踝关节腔单次给药表达

2.2 不同血清型重组腺相关病毒体内表达动力学

2.2.1 人、大鼠基因肌肉单次给药表达动力学

2.2.2 大鼠基因膝踝关节腔单次给药表达动力学

2.2.3 人来源融合基因肌肉表达组的抗体测定

2.2.4 大鼠来源融合基因肌肉表达组血清TNFα中和活性测定

三、实验结果

1.重组病毒体外表达和TNFα中和活性测定

2.携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因不同血清型重组病毒的体内表达

3.不同血清型重组腺相关病毒体内表达动力学

4.大鼠来源融合基因肌肉表达组血清TNFα中和活性测定

四、讨论

五、小结

参考文献

第三部分 重组腺相关病毒载体介导的大鼠肿瘤坏死因子受体：Fc基因对大鼠关节炎的治疗研究

第一节 大鼠类风湿关节炎模型的建立

一、实验材料

1.实验动物

2.试剂

3.主要仪器设备

二、实验方法

1.佐剂型大鼠关节炎模型的建立及注射部位对模型成功率的影响

2.AIA诱导不同品系大鼠的比较

3.Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎模型的建立及其诱导不同品系大鼠的比

4.大鼠关节炎病变评分标准

5.大鼠关节腔TNFα含量测定

三、结果：

1.佐剂大鼠关节炎模型建立及不同注射部位对大鼠关节炎指数影响

2.AIA尾根部注射诱导不同品系大鼠关节炎的比较

3.Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎模型的建立及其诱导不同品系大鼠的比较

4.大鼠关节腔TNFα含量测定

四、讨论

第二节 rAAV1，rAAV2载体介导的大鼠肿瘤坏死因子受体：Fc基因对大鼠关节炎的治疗研究

一、实验材料

1.实验动物

2.试剂

3.主要仪器设备

二、实验方法

(一) 实验动物分组及给药方案

(二) 宏观检测指标

1.大鼠踝关节炎症评分标准

2.大鼠踝关节X光片检测

3.大鼠踝关节组织化学检测

4.大鼠踝关节病理检测

5.大鼠脾脏重量差异

(三) 免疫、化学检测指标

1.ELISA测定大鼠血清、踝关节匀浆细胞因子

2.大鼠脾脏淋巴细胞体外增殖检测

3.大鼠脾脏淋巴细胞培养上清一氧化氮(NO)检测

4.流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测大鼠脾脏T淋巴细胞亚群

三、实验结果

(一) 宏观检测指标

1.CIA大鼠踝关节炎症评分结果

1.1rAAV2／ratTNFR：Fc抑制Ⅱ型胶原诱导的大鼠关节炎效果

1.1.1 踝关节内注射不同剂量rAAV2／ratTNFR：Fc抑制大鼠关节炎效果

1.1.2 踝关节注射不同剂量rAAV2／ratTNFR：Fc大鼠后足足径测量结果

1.2 不同血清型重组病毒不同给药途径抑制CIA大鼠关节炎效果

1.2.1 不同血清型重组病毒双侧踝关节给药抑制CIA大鼠关节炎效果

1.2.2 不同血清型重组病毒肌肉给药抑制CIA大鼠关节炎效果

1.2.3 不同血清型重组病毒双侧踝关节给药大鼠后足足径测量结果

1.2.4 不同血清型重组病毒肌肉给药大鼠后足足径测量结果

2.大鼠踝关节X光片检测

3.大鼠关节给药组踝关节组织化学检测

4.大鼠踝关节病理检测

5.大鼠脾脏重量差异

(二) 免疫、化学检测指标

1.ELISA测定各组大鼠细胞因子测定

2.大鼠脾脏淋巴细胞体外增殖检测

3.鼠脾脏淋巴细胞培养上清一氧化氮(NO)检测

4.流式细胞术检测大鼠脾脏T淋巴细胞亚群

四、讨论

五、小结

参考文献

个人简历

致谢

附录1 human TNFR序列

附录2 human IgG1 Fc序列

附录3 human TNFR：Fc连接区序列

附录4 rat TNFR序列

附录5 rat IgG1 Fc序列

附录6 rat TNFR：Fc连接区序列

发布时间: 2005-07-19

参考文献

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• [3].TNF-α相关基因单核苷酸多态性与类风湿关节炎的相关性及分子机制研究[D]. 肖会.安徽医科大学2017
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• [7].黄芩及Glucosamine/Chondroitin对类风湿性关节炎治疗作用的实验研究[D]. 陈曦.吉林大学2005
• [8].中医药治疗类风湿关节炎的作用环节和细胞免疫调控机理的研究[D]. 陈光星.广州中医药大学2005
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