细菌产胆固醇氧化酶与红色素的相关性研究

论文摘要

本文以产胆固醇氧化酶（EC1.1.3.6）红色短杆菌DGCCN-R为研究对象,以提高胆固醇氧化酶（COD）生成水平为目的,研究了这株红色菌株产COD和产色素的关系,试图利用这种相关性,创立一种理性、简易、可行的COD高产株筛子。遗传稳定性实验观察表明,红色菌株DGCCN-R转接8代之后,仍然保持高产COD和产红色素的性质,未观察到自发的回复突变,说明其产酶和产红色素具有遗传稳定性。经生理生化测试和16S rDNA测序鉴定,我们暂定此菌株名为红色短杆菌。研究了红色菌株DGCCN-R产COD与红色素,以及红色素与发酵液中底物胆固醇、胆固醇代谢产物胆甾-4-烯-3-酮的关系。发现菌株DGCCN-R产COD与产色素成正偶联关系。以超声波联合亚硝基胍的复合诱变方法,对红色菌株DGCCN-R进行了诱变处理,得到两株突变株DGCCN-W和DGCCN-P,DGCCN-W为白色菌落,DGCCN-P为淡粉色菌落。这两株变异株在菌落颜色变淡的同时,产酶能力也相应下降,说明出发菌株DGCCN-R本身产COD和产红色素存在着偶联关系。通过对培养基中主要碳、氮源,培养温度、通气量,以及培养基中添加金属离子的优化,分析了产酶和色素色价的关系。结果表明这些因素对菌株产酶和产色素的影响基本一致,从发酵水平说明菌株DGCCN-R产酶和产色素成正偶联关系。对菌种所产色素进行了分离提取,分析了色素与产酶在代谢上的关系。HPLC、UV、MS等仪器分析结果以及抑制剂实验表明,菌种产生的红色素为一类类胡罗卜素。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 胆固醇氧化酶的来源与应用前景
• 1.1.1 胆固醇氧化酶的来源与分布
• 1.1.2 胆固醇氧化酶的应用前景
• 1.2 红色细菌产生胆固醇氧化酶的概况
• 1.3 细菌红色素的生物合成与分离提取
• 1.3.1 红色素的生物合成
• 1.3.2 影响红色素生物合成的因素
• 1.3.3 红色素的分离提取方法
• 1.4 本课题研究的立足点和主要内容
• 第二章 红色菌株产COD 和红色素相关性的初步确定
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 胆固醇氧化酶检测液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养条件
• 2.2.2 胆固醇氧化酶活的测定
• 2.2.3 残留胆固醇测定
• 2.2.4 16S rDNA 提取测定
• 2.2.5 红色物质粗提取与全波长扫描分析
• 2.2.6 出发菌株处理
• 2.2.7 超声波结合亚硝基胍诱变处理
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 红色菌株遗传稳定性实验
• 2.3.2 红色菌株生理生化及分子鉴定
• 2.3.3 红色素粗提取后进行全波长扫描
• 2.3.4 红色菌株发酵不同时间产COD 与红色素的关系
• 2.3.5 诱变剂量的确定
• 2.3.6 复合诱变法验证COD 与红色素的偶连关系
• 2.4 本章小结
• 第三章 发酵条件对COD 和红色素生成的影响
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 培养条件
• 3.2.2 酶活测定方法
• 3.2.3 红色素粗提取和检测方法
• 3.2.4 色价相对单位定义
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 培养基中碳源、氮源和金属离子对产酶和色素色价的影响
• 3.3.2 摇瓶装液量和培养温度对产酶和色素色价的影响
• 3.3.3 4℃和光照条件下发酵液中色素稳定性和酶活稳定性
• 3.4 本章小结
• 第四章 红色素分析及其与COD 生成的关联性探讨
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 主要实验仪器
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 培养条件
• 4.2.2 红色素提取方法
• 4.2.3 红色素的分离纯化
• 4.2.4 红色素种类鉴定
• 4.2.5 红色素的紫外可见光谱测定
• 4.2.6 红色素的HPLC 检测条件
• 4.2.7 红色素的质谱分析条件
• 4.2.8 抑制剂吡氟酰草胺作用方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 硫酸显色反应及溶解性结果
• 4.3.2 红色素稳定性分析
• 4.3.3 红色素紫外可见光谱结果
• 4.3.4 红色素的HPLC 图谱
• 4.3.5 红色素的质谱图谱
• 4.3.6 抑制剂对色素生成的影响
• 4.4 本章小结
• 论文结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文