论文摘要
背景与目的:幽门螺杆菌（Hp）是一种定植于人类胃粘膜的革兰氏阴性杆菌,全世界人群感染率高达50%。Hp的感染与慢性胃炎和消化性溃疡有关,并且被认为是胃癌和MALT淋巴瘤的危险因素,因此根除治疗很有必要。目前最有效的根除方案是一种PPI制剂联合2种抗生素。虽然这种根除方案有较高的根除率,由于抗生素耐药率的升高,这些根除方案受到较大影响。近来国内外进行大量研究以揭示抗生素耐药产生的原因,认为抗生素耐药性的产生与基因突变有关;但它们的实验研究大多是基于原始耐药菌株或诱导耐药菌株而进行的,对于解释根除治疗失败后的耐药菌株具有一定局限性。本研究目的是调查近三年来南昌地区Hp对几种常用抗生素耐药率的变化;比较几种常用Hp根除治疗方案的疗效,同时分析Hp耐药对根除治疗的影响;研究根除失败的耐药菌株与原始敏感、耐药菌株及标准菌株之间耐药基因的DNA差异。方法:对有消化系统症状的患者,进行胃镜检查;对快速尿素酶试验阳性者,取胃粘膜2块,进行Hp培养,三年来共分离培养Hp菌株345例（均未行Hp根除治疗）。采用纸片扩散法对345例Hp临床分离菌株分别进行甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素和四环素药敏试验,筛选出各药物的耐药菌株和敏感菌株。将其中79例患者随机分入三个治疗组:A组PPI+AMX+CLA,B组PPI+CLA+MTZ, C组PPI+CBS+CLA+TI;79例患者根除治疗4周后进行14C-尿素呼气试验,筛选出根除失败的患者15例,另外补充筛选出18例经正规治疗根除失败者（根除治疗前未进行Hp培养或药敏实验）,共33例根除失败者,其中成功分离,培养,鉴定,保菌,药敏试验者20例（药敏试验包括甲硝唑、阿莫西林和克拉霉素）。从原始MTZR菌株、MTZS菌株、根除失败的MTZR菌株及Hp11637扩增rdxA基因;从原始AMXR菌株、AMXS菌株、根除失败的AMXR菌株及Hp11637扩增pbp1A基因;从原始CLRR菌株、CLRS菌株、根除失败的CLRR菌株及Hp11637扩增23S rRNA;PCR产物进行DNA测序,测序结果采用DNAStar软件分析,探讨临床菌株和标准菌株的DNA序列差异。结果:①2004、2005、2006年Hp对甲硝唑的耐药率分别为: 50.0%（102/204）,55.6%（25/45）,53.1%（51/96）,P >0.05;对阿莫西林的耐药率分别为4.4%（9/204）, 8.9%（4/45）,10.4%（10/96）,P >0.05;对克拉霉素的耐药率分别为8.8%（18/204）,11.1%（5/45）,9.4%（9/96）,P >0.05;对四环素的耐药率分别为4.4%（9/204）,4.4%（2/45）,5.2%（5/96）,P >0.05;三年来Hp对抗生素总的耐药率分别为:甲硝唑51.6%（178/345）,阿莫西林6.7%（23/345）,克拉霉素9.3%（32/345）,四环素4.6%（16/345）;甲硝唑与其他三种抗生素比较,P <0.05。②79例患者中根除失败者15例,根除率为81.0%（64/79）;其中A组根除率为87.8%（36/41）,B组根除率为72.7%（16/22）,C组根除率为75%（12/16）,P >0.05。③一种抗生素耐药的菌株根除率为61.1%（11/18）,双重耐药菌株根除率为0（0/5）,敏感菌株的根除率为94.6%（53/56）;敏感菌株与耐药菌株的根除率比较,P <0.01;一种抗生素耐药菌株的根除率与双重耐药菌株比较,P〈0.05。④Hp根除治疗失败后,甲硝唑、阿莫西林和克拉霉素的耐药率分别为85%（17/20）、25%（5/20）和50%（10/20）, P <0.05。⑤将甲硝唑的原始敏感菌株、原始耐药菌株、根除失败后耐药菌株的rdxA基因与标准菌株进行对比,核苷酸同源性较高, P >0.05;氨基酸同源性分析示,原始耐药菌株的氨基酸同源性低于原始敏感菌株和根除失败后的耐药菌株,P <0.05。⑥将阿莫西林原始敏感菌株、原始耐药菌株、根除失败后耐药菌株的pbp1A基因与标准菌株进行对比,核苷酸同源性较高,P >0.05。耐药菌株的框移突变比敏感菌株发生率高。氨基酸同源性分析示,耐药菌株的氨基酸同源性低于敏感菌株,统计学有显著差异,P <0.05。⑦将克拉霉素原始敏感菌株、原始耐药菌株、根除失败后耐药菌株的23S rRNA与标准菌株U27270及11637比较,发现在原始耐药菌株2144位点发生A-G突变为7/17例,根除失败后的耐药菌株发生A-T突变为5/8例,而敏感菌株2144位点均无突变0/15,P <0.05;此外,在根除失败后的耐药菌株2255位点发生G-T突变8/8例,2173位点发生G-T突变7/8例和2183位点发生T-C突变7/8例,而原始耐药菌株（0/17）及敏感菌株（0/15）在这些位点均未见突变,P <0.01。结论:①近三年来,各种抗生素耐药率无显著升高,甲硝唑是耐药率最高的抗生素。②抗生素耐药对根除Hp有显著影响,因此在耐药率高的南昌地区及周边地区,甲硝唑作为一线药物使用尚值得商榷。③以PPI为基础的几种常用Hp根除方案疗效基本相似。④根除失败后甲硝唑耐药率相当高,因此在二线根除治疗方案选择时使用甲硝唑应该慎重。⑤rdxA基因突变可能是甲硝唑原始耐药菌株产生耐药性的主要原因,但是根除失败后甲硝唑耐药菌株耐药性的产生可能还有其他原因。⑥PBP1蛋白的氨基酸置换在阿莫西林耐药菌株中较常见,可能与Hp对阿莫西林耐药有密切关系。⑦Hp 23S rRNA中的2144位点的突变与克拉霉素耐药有关,但原始耐药（A2144G）与根除失败后分离的耐药菌株（A2144T）突变形式不同;此外在根除失败的耐药菌株中发现的G2255T、G2173T和T2183C等热点突变,也可能与克拉霉素耐药有关,前两种突变形式为首次报道。