论文摘要
兔支气管败血波氏杆菌病是由支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)引起的一种家兔呼吸道传染病,常呈地方性流行,多为慢性,急性败血性死亡较少。该病病程长,反复发生,难治愈,给养兔业带来了严重的的经济损失。Bb的菌毛蛋白兼具毒力因子及免疫原的特性,其免疫原性已被证实。对fimN基因进行克隆表达和免疫原性分析,以重组蛋白为检测抗原建立间接ELISA诊断方法,为兔波氏杆菌临床快速检测和研制高效疫苗奠定良好的基础。本研究一共分为四部分内容,第一部分采用PCR技术扩增并克隆兔支气管败血波氏杆菌的fimN基因;第二部分以大肠杆菌原核pET-28a(+)为表达系统进行fimN基因的表达、纯化及表达蛋白免疫原性分析;第三部分是兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立;第四部分是兔支气管败血波氏杆菌间接ELISA诊断方法的建立。根据兔支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白的fimN基因序列,设计一对特异性引物,扩增出648bp的目的基因片段,将产物与pMD-19T载体连接,阳性质粒经双酶切和测序鉴定,结果表明,扩增的fimN基因与参考序列同源性可高达99%,成功构建了克隆载体。对pMD19T-fimN以及表达载体pET-28a(+)双酶切,连接转化后,获得重组质粒pETBb-fimN,双酶切和序列鉴定结果表明目的基因的插入位置和方向正确,加入IPTG诱导后经SDS-PAGE检测得到的目的蛋白大小约为27KD, Western blot检测结果显示,表达的蛋白能与Bb全菌阳性血清发生特异性结合,为后续的以重组fimN蛋白为包被抗原来建立间接ELISA快速诊断方法奠定基础。根据GenBank中支气管败血波氏杆菌fimN基因的短片段序列设计了一对特反应,且检出最低浓度为10pg,说明该方法敏感性高,特异性强,可用于临床检测。以表达并纯化的fimN蛋白为包被抗原,用fimN蛋白免疫实验兔制备血清作为阳性血清。优化反应条件,确定抗原和血清的最佳工作浓度,最佳封闭液、酶标二抗和血清的最佳作用时间,得出了阴性血清临界值为0.267,敏感性和特异性试验表明,该方法特异性强,敏感性高,用建立的间接ELISA方法检测随机采集的50份兔血清,结果显示阳性率为58%。该方法的建立为Bb血清学检测提供了新途径。
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摘要ABSTRACT目录符号说明文献综述1 支气管波氏杆菌的研究概况1.1 形态和培养特性1.2 抗原1.3 毒素1.3.1 腺苷环化酶溶血素1.3.2 皮肤坏死毒素或不耐热毒素1.3.3 气管细胞毒素1.4 其它生物学特性1.4.1 丝状血凝素1.4.2 百日咳杆菌黏附素1.4.3 菌毛1.4.4 Ⅲ型分泌系统(type-Ⅲ secretion system)2 支气管波氏杆菌病的研究现状2.1 支气管败血波氏杆菌病的流行性病学2.2 支气管败血波氏杆菌病的临床症状及病理变化2.3 支气管败血波氏杆菌病的防治措施3 支气管败血波氏杆菌病诊断方法的研究3.1 普通细菌学检测方法3.2 血清学诊断方法3.3 聚合酶链式反应(PCR)检测方法3.4 16SrRNA测序4 支气管波氏杆菌菌毛蛋白研究进展第一章 兔支气管败血波氏杆菌FIMN基因的克隆1 材料1.1 菌种和质料1.2 主要试剂2 方法2.1 fimN基因的扩增与克隆2.1.1 Bb基因组DNA的提取2.1.2 fimN引物设计和合成2.1.3 PCR反应扩增体系2.1.4 PCR产物的纯化2.2 目的基因的克隆2.2.1 产物与T载体连接2.2.2 感受态细胞制备2.2.3 转化2.3 重组质粒的提取与鉴定2.3.1 小量提取质粒(碱裂解法)2.3.2 重组质粒的鉴定3 结果3.1 fimN基因的扩增3.2 fimN在T载体中的克隆及鉴定3.2.1 PCR法鉴定3.2.2 重组质粒酶切鉴定3.2.3 目的基因的序列分析4 讨论第二章 FIMN基因的表达及免疫原性分析1 材判1.1 质粒和菌种1.2 主要试剂2 方法2.1 fimN基因原核表达载体的构建2.1.1 重组质粒DNA的双酶切处理及产物的回收2.1.2 连接反应2.1.3 连接产物转化2.1.4 重组质粒的提取及鉴定2.2 fimN基因的诱导表达及条件优化2.2.1 重组质粒pET28a-fimN转化2.2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达2.2.3 IPTG诱导培养时间的优化2.3 表达蛋白的纯化2.3.1 包涵体的获取与裂解2.3.2 重组表达蛋白的纯化2.4 重组表达蛋白的免疫原性分析3 结果3.1 fimN的原核表达载体的构建3.2 fimN基因的表达及条件优化3.2.1 fimN基因的表达3.2.2 表达时间优化3.3 重组表达蛋白的纯化3.4 重组表达蛋白的免疫原性分析4 讨论第三章 支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立1 材料1.1 菌种1.2 主要试剂2 方法2.1 引物设计与合成2.2 模板DNA的制备2.3 PCR反应体系2.4 PCR反应条件优化2.4.1 最佳退火温度2浓度梯度'>2.4.2 MgCl2浓度梯度2.4.3 引物最佳浓度2.5 PCR敏感性试验2.6 PCR特异性试验2.7 PCR扩增产物的克隆及目的片段的序列分析2.8 分离株的检测3 结果3.1 PCR扩增3.2 PCR反应条件优化3.3 PCR敏感性试验3.4 PCR特异性试验3.5 PCR扩增产物的克隆及目的片段的序列分析3.6 PCR法检测分离株4 讨论第四章 支气管败血波氏杆菌间接ELISA诊断方法建立1 材料1.1 抗原1.2 血清1.3 主要试剂2 方法2.1 阳性血清的制备2.2 ELISA最佳反应条件的选择2.2.1 抗原包被最佳浓度和阳性血清最适浓度的选择2.2.2 最佳封闭液的确定2.2.3 封闭时间的确定2.2.4 阴阳性血清最佳反应时间的确定2.2.5 酶标抗体作用时间的选择2.2.6 ELISA结果判定2.3 敏感性试验2.4 交叉反应试验2.5 阻断试验2.6 重复性试验2.7 ELISA方法的应用3 结果3.1 抗原包被最佳浓度和阳性血清最适浓度的选择3.2 最佳封闭液的确定3.3 最佳封闭时间3.4 阴阳性血清最佳反应时间的确定3.5 酶标抗体最佳作用时间的选择3.6 ELISA结果判定3.7 敏感性试验3.8 交叉反应试验3.9 阻断试验3.10 重复性试验3.11 ELISA方法的应用4 讨论结论参考文献附录 常用缓冲液及溶液配制致谢攻读学位期间取得的研究成果
相关论文文献
- [1].兔支气管败血性波氏杆菌fimN基因的原核表达[J]. 浙江农业学报 2011(05)
- [2].兔波氏杆菌fimN蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报 2013(11)
标签:支气管败血波氏杆菌论文; 基因论文; 原核表达论文; 蛋白纯化论文;
兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立
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