论文摘要
研究背景肝移植作为终末期肝病的唯一有效治疗手段正得到广泛的应用,其技术也日益成熟,病人术后5年存活率达到70%以上。随着高效、强力免疫抑制剂的广泛应用,急性排斥反应的发生率已明显降低,影响肝移植术后早期存活的主要因素越来越集中在肝脏、肾脏、小肠的功能损害方面,肝移植术后病人并发移植肝无功能、急性肾功能衰竭、小肠损伤而加重的内毒素血症使病人术后死亡率明显增加。原位肝移植手术技术复杂,经历供肝切取、供肝修整和受体手术三个阶段。在受体手术中,门静脉和下腔静脉需要阻断,恢复血流后肝脏、肾和小肠要经历缺血再灌注损伤。而缺血再灌注损伤是肝移植术后病人并发移植肝无功能、急性肾功能衰竭、小肠损伤而加重的内毒素血症的重要因素。细胞凋亡是缺血再灌注损伤早期肝细胞死亡的主要方式,许多基因参与了细胞凋亡的调控,其中目前研究最多,认为最主要的调控基因为Bcl-2基因及Fas基因。目前研究热点主要集中在缺血再灌注损伤前后肝脏的细胞凋亡及干预方面,对于肝脏组织在肝移植术后多长时间达到细胞凋亡高峰国内外有不同的研究结果。另外,在原位肝移植手术中,受体大鼠肝脏切除、供肝植入阶段需要阻断门静脉及下腔静脉,此时肾脏及小肠的动脉血供无明显变化,但是静脉回流明显受阻,出现肾脏及小肠器官淤血。当门静脉及下腔静脉吻合完毕,再次开放时,肾脏及小肠组织静脉回流恢复,淤血得以解除。这一种形式的缺血再灌注损伤称之为“淤血再灌注损伤”似乎更为准确,与肝脏所经历的动脉缺血后引发的缺血再灌注损伤相比,其对机体的损伤较轻。对于肾脏及小肠在肝移植“淤血再灌注损伤”前后的细胞凋亡及基因调控方面的变化规律尚未有相关的文献报道。本文通过研究原位肝移植缺血再灌注损伤后移植肝、肾脏及小肠组织中的细胞凋亡的变化规律,同时研究Bcl-2和Fas基因表达在损伤细胞中的动态变化规律,并探讨细胞凋亡和Bcl-2、Fas基因表达存在的内在相互关系,进一步阐述移植肝无功能、急性肾功能衰竭、小肠损伤而加重的内毒素血症的发生机制。无论是在实验研究还是在临床上的治疗方面具有指导意义。目的:（1）探讨建立稳定的大鼠原位肝移植模型的方法,观察Wistard→Wistard大鼠模型的稳定性及是否符合实验要求,从而建立适宜、可靠的大鼠原位肝移植模型。（2）对比研究大鼠肝移植实验组及对照组的肝、肾脏及小肠组织中的细胞凋亡变化规律。（3）对比研究大鼠肝移植实验组及对照组的肝、肾脏及小肠Bcl-2、Fas基因表达的变化规律,探讨其可能的发生机制。方法:（1）参照Kamada“二袖套法”,加以适当改进,建立Wistard→Wistard大鼠原位肝移植动物模型,并以假手术组大鼠为对照组。测定两组术后1、3、6、12、24小时血浆谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）水平变化。（2）实验组及对照组大鼠分别于术后1、3、6、12、24小时时分别处死,获取肝脏、肾脏及小肠组织,对相应的标本进行病理学检查。应用免疫组化（SP）法检测肝脏、肾脏及小肠组织中凋亡细胞在术后不同时间点的Fas蛋白表达,应用细胞流式技术及电镜技术对术后不同时间点的肝脏、肾脏及小肠组织中凋亡细胞进行定性及定量分析。（3）应用逆转录法（RT-PCR法）检测肝脏、肾脏及小肠组织中Bcl-2和Fas基因表达在术后不同时间点的表达变化规律。以上数据以均数±标准差表示,以SPSS软件进行统计学分析,P＜0.05为差异有显著性。结果:（1）运用改良Kamada二袖套法成功建立了Wistard→Wistard大鼠原位肝移植模型,手术成功率为90.9%。（2）应用免疫组化法发现两组大鼠的肝脏、肾脏及小肠组织术后1小时即发生细胞凋亡,在12小时时达到高峰,实验组明显高于对照组,存在显著差异（P＜0.05）);（3）应用细胞流式技术对不同组织中的凋亡细胞进行检测,发现实验组及对照组中肝脏、肾脏及小肠组织均发生细胞凋亡,术后1小时即出现,在12小时时达到高峰,实验组明显高于对照组（P＜0.05）。（4）应用RT-PCR法发现术后1小时Bcl-2及Fas基因在肝脏、肾脏及小肠组织细胞中开始出现表达,并在12小时时达到高峰。而且实验组和同对照组有显著性差异（P＜0.05）。Bcl—2基因表达升高的幅度小于Fas基因。结论:（1）运用改良Kamada二袖套法建立稳定而确切的Wistard→Wistard大鼠的原位肝移植模型是可行的。（2）肝移植缺血再灌注可致移植肝、肾和小肠损伤,尤其肝、肾功能损伤明显,其改变也最显著;（3）肝移植缺血再灌注损伤可致肝、肾和小肠细胞凋亡,术后1小时即明显增加,其后逐渐增高,至术后12小时至最高。肝脏的细胞凋亡率最高,小肠的细胞凋亡率最低。（4）细胞凋亡是肝移植缺血再灌注损伤后肾脏及小肠细胞早期死亡的主要形式。（5）肝移植缺血再灌注损伤导致肝、肾脏及小肠组织Bcl-2和Fas基因表达的升高,与细胞凋亡的变化规律一致,两者具有正相关性。Bcl-2基因表达升高的幅度小于Fas基因。