白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5和多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的分离及其功能验证

论文摘要

十字花科作物是农业生产中最重要的作物种类之一,在生产上广泛利用雄性不育系生产其一代杂种。对雄性不育机理的研究可以了解小孢子的发育机制,理解花粉发育的进程,还可以为人工创造雄性不育系提供理论依据,在生产实践和理论上都具有十分重要的意义。我们实验室采用cDNA-AFLP技术从白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Markino）减数分裂胞质分裂突变体mmc （male meiotic cytokinesis）的野生型（可育株）中分离到两个与花粉育性密切相关的差异片段,其中一个与花粉外壁蛋白（pollen coat protein,PCP）基因高度同源,另一个与植物多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase, PG）基因序列相似性较高。早期的研究表明,这两个差异片段在mmc突变体的野生型中蕾、大蕾和开放花中特异表达,在mmc突变体（不育株）中完全不表达,表明这两个差异片段是属于决定花粉育性的晚期表达基因,但其确切的生物学功能还不清楚。在本研究中,我们拟通过构建其反义和RNA干涉载体转基因的方法,对菜心[B.campestris L.ssp.chinensis Markino var. parachinensis （Bailey） Tsen et Leel进行转化,以获得这两个基因功能缺失突变体,从而分析其在花粉发育进程中的生物学功能。获得的主要结果如下: （1）在已有cDNA-AFLP差异片段的基础上,利用RACE技术获得花粉发育相关的PCP基因BcMF5利PG基因BcMF6的cDNA和DNA序列全长。序列分析表明,BcMF5基因的cDNA序列全长的最大ORF框为252bp,其DNA序列全长含有1个长度为268-bp的内含子。同源分析表明BcMF5基因属于PCP-A基因家族的成员,与SLR1-BP基因的同源性最高,具有PCP的典型结构特征,在花粉和柱头互作及自交不亲和反应的花粉识别中起作用。BcMF6基因的cDNA序列全长的最大ORF框为1194bp,其DNA序列全长包含3个内含子和4个外显子,内含子的长度依次为81bp、95bp和127bp,序列分析表明其含有一PG活性位点(227RVTCGPGHGIS.IGS240),同源比对和系统树构建表明,BcMF6基因属于花粉发育过程中特异表达的PG基因。 （2）构建了BcMF5基因含有组成型启动子CaMV35S的RNA干涉载体pBI35S-RMF5和含有绒毡层特异表达启动子A9、BcA9的RNA干涉载体pBIA9-RMF5和pBIBcA9-RMF5。并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF5基因RNA干涉表达载体导入菜心中,获得了BcMF5基因干涉载体的菜心转基因植株。 （3）构建了BcMF6基因含有组成型启动子CaMV35S的反义载体pBI35S-AMF6和含有绒毡层特异表达启动子A9、BcA9的反义RNA载体pBIA9-AMF6和pBIBcA9-AMF6。并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF6基因反义RNA表达载体导入菜心中,获得了BcMF6基因反义载体的菜心转基因植株。

论文目录

• 缩写词
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 PCP的研究
• 1.1.1 PCP的来源
• 1.1.2 PCP基因家族
• 1.1.2.1 花粉SI决定因子
• 1.1.2.2 PCP-A花粉外壁蛋白
• 1.1.2.3 PCP-B花粉外壁蛋白
• 1.1.3 花粉识别和SI反应的模型
• 1.2 植物多聚半乳糖醛酸酶的研究
• 1.2.1 PG的作用方式和组织定位
• 1.2.2 不同PG基因家族之间序列的差异性
• 1.2.3 PG功能的多样性
• 1.2.3.1 PG与果实成熟
• 1.2.3.2 PG与器官脱落
• 1.2.3.3 PG与花粉授粉
• 1.2.4 PG基因的表达调控及应用
• 2 白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5的克隆及其功能分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 花粉外壁蛋白基因BcMF5的克隆及序列分析
• 2.1.1.1 材料与试剂
• 2.1.1.2 基因组DNA和总RNA的提取及其反转录
• 2.1.1.3 差异片段A10T17、A10T19的RACE扩增
• 2.1.1.4 BcMF5基因cDNA和DNA序列全长的扩增
• 2.1.2 BcMF5基因RNAi载体构建
• 2.1.2.1 菌株与质粒
• 2.1.2.2 反义链片段和正义链片段的获得
• 2.1.2.3 反义片段和正义片段的制备
• 2.1.2.4 双元载体pBI121制备
• 2.1.2.5 表达质粒的构建过程
• 2.1.2.6 冻融法转化农杆菌
• 2.1.2.7 农杆菌中质粒的鉴定
• 2.1.3 BcMF5菜心转基因植株的获得
• 2.1.3.1 植物材料、菌株及抗生素
• 2.1.3.2 培养基
• 2.1.3.3 预培养
• 2.1.3.4 共培养
• 2.1.3.5 分化培养
• 2.1.3.6 继代及生根
• 2.1.3.7 移栽
• 2.1.4 BcMF5菜心转基因植株的分子检测及其功能分析
• 2.1.4.1 植物材料
• 2.1.4.2 BcMF5菜心转基因植株基因组DNA利总RNA的提取
• 2.1.4.3 BcMF5菜心转基因植株的PCR检测
• 2.1.4.4 BcMF5菜心转基因植株的Southern印迹杂交检测
• 2.1.4.5 BcMF5菜心转基因植株的Northern印迹杂交检测
• 2.1.5 BcMF5菜心转基因植株的小孢子发育的形态与细胞学观察
• 2.1.5.1 试验材料
• 2.1.5.2 BcMF5菜心转基因植株的花粉萌发试验
• 2.1.5.3 BcMF5菜心转基因植株花粉生活力及扫描电镜观察
• 2.1.5.4 BcMF5菜心转基因植株授粉柱头的苯胺蓝染色观察
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 花粉外壁蛋白基因BcMF5的克隆及序列分析
• 2.2.1.1 mmc野生型差异片段A10T17、A10T19与SLRI-BP、PCP-A2的序列比较
• 2.2.1.2 A10T19的5’RACE扩增
• 2.2.1.3 A10T19的5’RACE测序分析
• 2.2.1.4 A10T17和A10T19的3’RACE测序分析及3’-UTR不同长度转录本的分离
• 2.2.1.5 A10T17和A10T19的3’RACE的序列分析
• 2.2.1.6 A10T17和A10T19各cDNA拼接全长的序列分析
• 2.2.1.7 BcMF5基因cDNA和DNA序列全长的获得
• 2.2.1.8 BcMF5基因cDNA利DNA全长序列分析
• 2.2.2 BcMF5基因RNAi载体构建
• 2.2.2.1 BcMF5正义片段和反义片段的获得
• 2.2.2.2 BcMF5的35s-pBI121干涉载体的构建
• 2.2.2.3 BcMF5的A9-pBI121干涉载体的构建
• 2.2.2.4 BcMF5的BcA9-pBI121干涉载体的构建
• 2.2.2.5 农杆菌中质粒的鉴定
• 2.2.3 BcMF5基因菜心转基因植株的获得
• 2.2.4 BcMF5菜心转基因植株的的分子检测及其功能分析
• 2.2.4.1 BcMF5菜心转基因植株的基因组DNA和总RNA的提取
• 2.2.4.2 BcMF5菜心转基因植株的PCR检测
• 2.2.4.3 BcMF5菜心转基因植株Southern印迹杂交检测
• 2.2.4.4 BcMF5菜心转基因植株的Northern印迹杂交检测
• 2.2.5 BcMF5菜心转基因植株的花粉发育的形态与细胞学观察
• 2.2.5.1 BcMF5菜心转基因植株的花粉萌发试验
• 2.2.5.2 BcMF5菜心转基因植株花粉生活力及扫描电镜观察
• 2.2.5.3 BcMF5菜心转基因植株授粉柱头的苯胺蓝染色观察
• 2.3 讨论
• 2.3.1 BcMF5，一个新的PCP基因
• 2.3.2 含有内含子剪切的hpRNA载体能产生高效的RNAi效应
• 2.3.3 BcMF5的可能功能
• 2.3.4 CaMV35S启动子在菜心花粉中的表达
• 3 BcMF5基因3’-UTR不同长度转录本的时空表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料与试剂
• 3.1.2 BcMF5基因3’-UTR不同转录本的RT-PCR分析
• 3.1.3 3’-UTR不同转录本的PCR-Southern和Northern杂交检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 BcMF5基因的3’-UTR各转录本序列的比较
• 3.2.2 BcMF5的3’-UTR各转录本的RT-PCR分析
• 3.2.3 BcMF5的3’-UTR转录本的PCR-Southern杂交和Northern杂交检测
• 3.3 讨论
• 4 BcMF5基因启动子的克隆及其功能的初步分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 BcMF5基因启动子的克隆
• 4.1.1.1 菌株与质粒
• 4.1.1.2 DNA提取及启动子序列扩增
• 4.1.1.3 启动子序列分析
• 4.1.2 BcMF5基因启动子缺失表达载体的构建
• 4.1.2.1 菌株与质粒
• 4.1.2.2 启动子片段的获得
• 4.1.2.3 双元载体pBI121制备
• 4.1.2.4 启动子片段的制备
• 4.1.2.5 表达质粒的构建过程
• 4.1.2.6 冻融法转化农杆菌
• 4.1.2.7 农杆菌中质粒的鉴定
• 4.1.3 BcMF5启动子菜心转化植株的获得
• 4.1.4 BcMF5启动子功能分析
• 4.1.4.1 植物材料
• 4.1.4.2 BcMF5启动子菜心转化植株Southern杂交检测
• 4.1.4.3 BcMF5启动子菜心转化植株花粉的GUS染色观察
• 4.1.4.4 BcMF5启动子菜心转化植株的测交
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 BcMF5启动子的克隆
• 4.2.1.1 BcMF5启动子序列扩增
• 4.2.1.2 BcMF5基因启动子序列组成分析
• 4.2.1.3 BcMF5启动子序列元件分析
• 4.2.2 BcMF5基因启动子缺失表达载体构建
• 4.2.2.1 BcMF5基因启动子片段扩增
• 4.2.2.2 BcMF5基因启动子片段的序列分析
• 4.2.2.3 BcMF5基因启动子缺失表达载体的构建
• 4.2.2.4 BcMF5启动子缺失表达载体的验证
• 4.2.3 BcMF5启动子功能的初步分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 BcMF5启动子的克隆
• 4.3.2 BcMF5启动子功能分析
• 5 白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的克隆及功能分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的克隆及序列分析
• 5.1.1.1 植物材料与试剂
• 5.1.1.2 BcMF6 cDNA和DNA全长的获得
• 5.1.1.3 BcMF6核苷酸序列分析
• 5.1.2 白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的反义RNA载体构建
• 5.1.2.1 菌株与质粒
• 5.1.2.2 反义片段的获得
• 5.1.2.3 反义片段的制备
• 5.1.2.3 双元载体pBI121制备
• 5.1.2.5 表达质粒的构建
• 5.1.2.6 冻融法转化农杆菌
• 5.1.2.7 农杆菌中质粒的鉴定
• 5.1.3 BcMF6菜心转基因植株的获得
• 5.1.4 BcMF6菜心转基因植株的分子检测及其功能分析
• 5.1.4.1 植物材料
• 5.1.4.2 BcMF6菜心转基因植株基因组DNA和总RNA的提取
• 5.1.4.3 BcMF6菜心转基因植株的PCR检测
• 5.1.4.4 BcMF6菜心转基因植株的Southern印迹杂交检测
• 5.1.4.5 BcMF6菜心转基因植株的Northern印迹杂交检测
• 5.1.5 BcMF6菜心转基因植株的花粉发育的形态与细胞学观察
• 5.1.5.1 试验材料
• 5.1.5.2 BcMF6菜心转基因植株的花粉萌发试验
• 5.1.5.3 BcMF6菜心转基因植株花粉的生活力及扫描电镜观察
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的克隆及序列分析
• 5.2.1.1 RACE获得BcMF6的3’-UTR和5’-UTR序列
• 5.2.1.2 BcMF6基因DNA和cDNA全长的获得
• 5.2.1.3 BcMF6核苷酸序列分析
• 5.2.1.4 BcMF6基因的同源比对与系统树构建
• 5.2.2 BcMF6基因反义RNA载体的构建
• 5.2.2.1 BcMF6基因反义片段的获得
• 5.2.2.2 BcMF6基因35S-PBI121反义表达载体的构建
• 5.2.2.2 BcMF6基因A9-PBI121反义表达载体的构建
• 5.2.2.3 BcMF6基因BcA9-PBI121反义表达载体的构建
• 5.2.2.4 BcMF6基因反义表达载体农杆菌中质粒的鉴定
• 5.2.3 BcMF6菜心转基因植株的获得
• 5.2.4 BcMF6菜心转基因植株的分子检测及其功能分析
• 5.2.4.1 BcMF6菜心转基因植株的总DNA和RNA提取
• 5.2.4.2 BcMF6菜心转基因植株的PCR检测
• 5.2.4.3 BcMF6菜心转基因植株的Sourthern杂交检测
• 5.2.4.4 BcMF6菜心转基因植株的Northern杂交检测
• 5.2.5 BcMF6菜心转基因植株花粉发育的形态与细胞学观察
• 5.2.5.1 BcMF6菜心转基因植株的花粉萌发试验
• 5.2.5.2 BcMF6菜心转基因植株花粉的生活力及扫描电镜观察
• 5.3 讨论
• 5.3.1 BcMF6，一个新的花粉表达的PG基因
• 5.3.2 BcMF6在白菜花粉发育过程中的可能功能
• 结论
• 参考文献