重组人TRIM5α基因嵌合体的构建、表达纯化及其体外抑制HIV-1的研究

论文摘要

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒感染所导致的以全身免疫系统的严重损害为特征的,以患者易于发生机会性感染以及肿瘤为特征的临床综合征。全球约95%以上的艾滋病感染是由HIV-1造成的。自1981年美国报道首例艾滋病患者以来,全球已有超过2500万人死于艾滋病。近年来,科学家希望从细胞内天然的抗HIV分子的方向上为解决艾滋病的问题提供重要的途径。已有的研究表明,HIV-1病毒可以感染包括人类在内的许多哺乳类细胞,但却不能感染某些猴。2004年,Sodroski研究小组对这一事实进行研究,在灵长类细胞中发现了一种可以抗HIV-1的蛋白质,研究证明属于三结构域蛋白（tripartite motif,TRIM）家族的一个成员,定义为TRIM5α。新近发现猿猴细胞中的TRIM5α具有抗HIV-1的作用。从而使TRIM5α的研究引起广泛关注。但到目前为止,人们对于TRIM5α限制HIV-1复制的作用机制尚不完全清楚,许多问题还没有解决,大多停留在推测的水平。比如,TRIM5α的不同类型对不同物种病毒感染的抑制偏向原因是什么?它是否直接与HIV-1的核衣壳蛋白结合?TRIM5α还可能与其他什么蛋白结合?虽然人的TRIM5α也具有同样功能,但不如恒河猴的有效。然而,当有个别氨基酸改变时,人源的TRIM5α将具有和恒河猴TRIM5α相似水平的抗HIV-1功能。早期的临床试验证明异种蛋白应用于人体后,可引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应,重复使用时甚至可导致病人严重的过敏性休克。此外,由于人抗异种动物的免疫应答反应的存在,异种蛋白在人体内往往被快速清除,其半衰期也较短。因此本实验室选择人源的TRIM5α（改构体）进行研究。以往关于TRIM5α的绝大多数研究,主要围绕在基因水平上进行的,例如,通过脂质体、病毒载体等结构将TRIM5α基因转运进入细胞使之大量表达,从而改变细胞的表型。但在实际操作过程中,往往存在这样那样的问题,如可操作性差,转运效率低,稳定性不好,生物毒性作用,而且并非所有细胞均能被转染等,这些均限制了其实际应用。使得目前关于TRIM5α的研究只能局限在细胞的水平上,严重阻碍了这一重要基因向临床治疗中的发展。如果能够体外得到大量的有生物学活性的TRIM5α蛋白,而且该蛋白又能穿过细胞膜,在细胞内发挥其本来的生物学活性,那么TRIM5α的应用范围将大大拓展。近年来,人们发现了一种蛋白质功能域,它们能够引领其所承载的生物大分子通过浆膜,并在细胞内积累,所以把它们称为蛋白质转导域（protein transductiondomain,PTD）。被PTD带入细胞的分子都还具有它们本来的活性。PTD的出现,使大分子蛋白质或多肽自由通透细胞膜成为了可能,疾病的一个新治疗平台——蛋白质治疗技术也成为了现实,加速了蛋白质工程技术的发展和临床上蛋白类药物的开发和利用。目前,已有数十种蛋白质被成功转导进入不同的细胞中,并被表现其相应的生物活性,还有部分蛋白被转导进入动物体内。随着其作用机理的阐明和这一技术的日益成熟,将被越来越广泛地应用到疾病治疗方法的研究以及未知蛋白功能的研究中。但体外获得的重组蛋白PTD-TRIM5α能否顺利穿过细胞膜进入到细胞内,外源性TRIM5α蛋白是否具有抑制HIV-1的作用?这些问题都值得我们去研究。并且目前国内外还未见报道。Matthew Stremlau等的研究表明,突变的TRIM5αH（R328-332）[即I→M（328）、G→Q（330）、R→P（332）]基因用逆转录病毒载体转染细胞后,具有较好的抑制HIV-1的作用。考虑到逆转录病毒载体的生物毒性作用（如致白血病等肿瘤）,操作复杂,难于调控等诸多不足。本实验室构建了该改构体（嵌合体）PTD融合的原核表达载体,并对该蛋白的表达、纯化和功能进行了初步的研究。目的:克隆人TRIM5α基因并对其编码序列进行分析。构建TRIM5α改构体TRIM5αH（R328-332）的原核表达载体pET28α。并通过表达获得重组的TRIM5α及TRIM5αH（R328-332）蛋白。并探讨重组蛋白体外抑制HIV-1的作用。方法:利用RT-PCR方法克隆人TRIM5α基因;通过与基因组序列对比分析基因组结构;用BioEdit,Genedoc和MEGA 4.1进行蛋白序列联配和进化分析。构建PTD-TRIM5α及其嵌合体PTD-TRIM5αH（R328-332）的原核表达载体（pET-28a）。转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达获得重组融合蛋白。重组蛋白再经过纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot分析重组蛋白。用免疫共沉淀和ELISA等方法探讨重组蛋白结合HIV-1Gag的能力,利用荧光显微镜证实PTD-TRlM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）具有高效的穿膜能力,从而为进一步研究重组蛋白细胞内功能奠定了基础。将HIV-1ⅢB和Molt 4靶细胞混合培养,然后与不同浓度的药物作用后,用合胞体形成抑制实验检测药物对HIV-1ⅢB的直接灭活作用;用HIV-1p24抗原检测试剂盒检测药物作用后细胞培养上清的p24抗原水平变化,以测定其体外抑制HIV-1的作用。结果:扩增了一个长1482bp的基因片断,序列分析表明其覆盖了完整编码框,编码由493个氨基酸组成的人TRIM5α基因。人TRIM5a蛋白和黑猩猩、大猩猩、猩猩、猕猴（恒河猴）TRIM5α蛋白的相似度分别为98.2%、96.8%、93.7%和87.6%。采用PCR和测序方法证实目的基因已正确地插入pET28a载体。用Western blot证实含有目的基因的重组PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）成功实现了表达,采用镍柱亲和层析得到了纯度约90%的目的蛋白。PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）经稀释和透析等处理后实现了复性。体外实验证实PTD—TRIM5α及PTD—TRIM5αH（R328-332）蛋白具有和HIV-1Gag结合的能力,利用荧光显微镜证实PTD-TRIM5αH（R328-332）具有高效的穿膜能力。测定二种蛋白能够抑制HIV-1ⅢB介导的细胞融合的EC50分别为81.47μg/mL、7.55μg/mL;抑制p24抗原产生的EC50分别为62.04μg/mL、4.74μg/mL。结论:成功克隆人TRIM5α基因,成功构建了PTD-TRIM5α/pET28a及PTD-TRIM5αH（R328-332）/pET28a的大肠杆菌表达系统,并且表达、分离纯化出具有生物活性的PTD-TRIM5α及PTD-TRIM5αH（R328-332）蛋白。PTD—TRIM5α及PTD—TRIM5αH（R328-332）蛋白具有高效的穿膜能力,从而为进一步研究重组蛋白细胞内功能奠定了基础。PTD-TRIM5αH（R328-332）具有更好的抑制HIV-1的活性,PTD-TRIM5αH（R328-332）抑制HIV-1ⅢB的效率比PTD-TRIM5α高10倍以上。PTD—TRIM5α及PTD—TRIM5αH（R328-332）蛋白和HIV-1Gag结合的能力和其抑制HIV-1的活性相关。

论文目录

摘要

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第一章绪论

1.艾滋病和HIV

1.1 艾滋病流行情况

1.2 艾滋病的病原学特点

1.2.1 HIV颗粒结构

1.2.2 HIV基因结构、编码蛋白及其功能

1.3.抗艾滋病药物的作用靶点

1.3.1 HIV-1逆转录酶抑制剂

1.3.2 蛋白酶抑制剂

1.3.3 整合酶抑制剂

4为靶点'>1.3.4 以宿主细胞CD₄为靶点

1.3.5 以HIV-1 gp120为靶点

1.3.6 阻断HIV-1 gp120与协同受体的结合抑制剂

1.3.7 阻断HIV-1 gp41与靶细胞膜的融合抑制剂

2 天然免疫分子TRIM5α的研究简介

2.1 TRIM5α蛋白抗HIV-1作用的发现

2.2 TRIM5分子的结构特点

2.3 TRIM5α分子限制HIV-1感染和复制的作用机制

2.4 与TRIM5α同源的蛋白

2.5 讨论

2.6 研究展望

3.穿膜肽是一种高效低毒的蛋白运载工具

3.1 穿膜肽的发现与研究意义

3.2.PTD的种类

3.2.1 单纯疱疹病毒（HSV）VP22蛋白

3.2.2 HIV病毒的Tat蛋白

3.2.3 果蝇触角蛋白同源结构域（DrosophilaAntermapediaHomeodomain,AntpHD）

3.2.4 人工设计的PTD

3.2.5 其他PTD蛋白

3.3 穿膜肽的跨膜机制

3.3.1 穿膜肽内在化作用的基本特点

3.3.2 穿膜肽可能的跨膜机制

参考文献

第二章人天然免疫基因TRIM5α的克隆、序列及进化分析

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和载体

2.1.2 PCR引物序列

2.1.3 试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 主要溶液及缓冲液的配制

2.1.6 生物信息学分析的主要软件与数据库

2.2 实验方法

2.2.1 引物合成

2.2.2 HeLa细胞总RNA的提取（TRIzol法）

2.2.3 两步法RT-PCR

2.2.4 TRIM5α/PUC57-T重组质粒的构建及鉴定

3 结果

3.1 细胞总RNA抽提

3.2 TRIM5α基因的PCR扩增及鉴定

3.3 TRIM5α/pUC57-T重组子的筛选及PCR鉴定

3.4 测序结果

3.5 人TRIM5α基因的序列分析

3.5.1 人TRIM5α基因的染色体定位分析

3.5.2 TRIM5α蛋白质理化特性

3.5.3 TRIM5α信号肽分析

3.5.4 TRIM5α跨膜预测

3.5.5 用DNAMAN进行同源性比较

3.5.6 TRIM5α序列联配及进化分析

3.5.8 TRIM5α二级结构预测

3.5.9 蛋白质基序分析

4 讨论

参考文献

第三章 PTD-TRIM5α及PTD-TRIM5αH（R328-332）的构建、表达与纯化复性

1 引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2.1 克隆载体及克隆菌株

2.2.2 主要仪器设备

2.2.3 主要试剂

2.2.4 主要溶液及试剂配制

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 PCR反应

2.2.3 PCR产物的检测与回收

2.2.4 PCR产物的TA克隆

2.2.5 载体的制备及酶切

2.2.6 酶切产物的连接及转化

2.2.7 阳性克隆的鉴定

2.2.8 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）在大肠杆菌中的表达与鉴定

2.2.9 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的镍柱亲和层析

2.2.10 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的复性

3 结果与分析

3.1 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）基因的扩增

3.2 重组质粒PTD-TRIM5α/pET28a和PTD-TRIM5αH（R328-332）/pET28a的鉴定

3.2.1 重组质粒TRIM5α/pEASY和TRIM5αH（R328-332）/pEASY的酶切鉴定

3.2.2 阳性菌落的PCR鉴定

3.2.3 重组质粒的测序鉴定

3.3 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）在BL21（DE3）中的表达

3.4 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的Western blot验证

3.5 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的亲和层析

3.6 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的复性和脱盐浓缩

4 讨论

参考文献

第四章人TRIM5α及其嵌合体蛋白与HIV-1Gag蛋白体外分子间相互作用的鉴定

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

2.1.2.溶液配制

2.2 方法

2.2.1 TRIM5α/TRIM5αH（R328-332）蛋白与HIV-1Gag蛋白的免疫共沉淀

2.2.2 TRIM5α/TRIM5αH（R328-332）蛋白与HIV-1Gag蛋白的His pull down

2.2.3 TRIM5α/TRIM5αH（R328-332）蛋白与HIV-1Gag蛋白相互作用的ELISA鉴定

3 结果

3.1 TRIM5α/TRIM5αH（R328-332）蛋白与HIV-1Gag蛋白的免疫共沉淀

3.2 TRIM5α/TRIM5αH（R328-332）蛋白与HIV-1Gag蛋白（CN-54,55kD）的His pull down

3.3 TRIM5α/TRIM5αH（R328-332）蛋白与HIV-1Gag蛋白相互作用的ELISA鉴定

4 讨论

参考文献

第五章 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的体外抑制HIV-1的研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞和病毒

2.1.2 主要设备

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要溶液

2.2 方法

2.2.1 重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的穿膜研究

2.2.2 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的细胞毒性研究

2.2.3 HIV-1与Molt4细胞的共培养

ⅢB诱导的细胞合胞体形成抑制实验'>2.2.4 药物对HIV-1_ⅢB诱导的细胞合胞体形成抑制实验

2.2.5 药物对HIV-1的抑制作用实验

3 结果与分析

3.1 浓度和时间对重组蛋白穿膜效率的影响

3.2 重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）对Molt4的穿膜效率

3.4 药物在体外对Molt4细胞的毒性作用

ⅢB诱导的细胞合胞体形成抑制作用'>3.5 药物对HIV-1_ⅢB诱导的细胞合胞体形成抑制作用

3.6 药物对培养上清中p24抗原水平的影响

4 讨论

4.1 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的穿膜及靶向性

4.2 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH（R328-332）的细胞毒性和对细胞增殖的影响

4.3 重组蛋白对HIV-1的抑制作用作用

参考文献

结论、创新性与展望

结论

创新性

问题与展望

致谢

附录

A.攻读博士学位期间论文发表及科研成果情况

B.攻读博士学位期间参加科研项目

缩略语表

附录图 1 TRIM5α的测序结果（正向）

附录图 1 TRIM5α的测序结果（反向）

附录图 2 PTD-TRIM5αH（R328-332）的测序结果（正向）

附录图 2 PTD-TRIM5αH（R328-332）的测序结果（反向）

附录图 3 PTD-TRIM5α的测序结果（正向）

附录图 3 PTD-TRIM5α的测序结果（反向）

重组人TRIM5α基因嵌合体的构建、表达纯化及其体外抑制HIV-1的研究

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