论文摘要
急性白血病（Acute Leukemia,AL）是儿童期发病率最高的恶性肿瘤。其中B系来源的急性淋巴细胞性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL）是儿童白血病最常见的类型。联合化疗的应用虽然明显改善了儿童ALL的预后,但仍有20～30%的病死率。治疗失败的主要原因是白血病细胞耐药和化疗的毒副作用。与化疗比较,靶向治疗具有高度的选择性和特异性,因而可大大提高疗效,降低药物的毒副作用。白血病细胞系列特异性表面分化抗原（Cluster Differentiation,CD）分子的单克隆抗体（Monoclonal Antibody,简称单抗,McAb）可以作为白血病/淋巴瘤靶向治疗的先导分子。目前大多数高亲和力的单克隆抗体是鼠源性的,天然的鼠源性单抗应用于人体,作为异种蛋白可刺激人体产生人抗鼠抗体（Hhuman Anti-Mouse Antibody,HAMA）,既影响单抗的治疗效果,又可能诱发严重的过敏反应,大大限制了单抗在人体的应用;因此有必要对其进行降低免疫原性而保留抗原结合力的改造。抗体的免疫原性主要位于恒定区Fc段,而抗原结合活性位于可变区Fv段。改造方法之一是制备人-鼠嵌合型抗体,用人的Fc段基因替代鼠Fc段基因,保留鼠源性Fv段基因,然后利用现代基因工程技术表达嵌合抗体蛋白。当前临床使用的抗人CD20嵌合型抗体美罗华（Rituximab）便是嵌合型抗体成功应用于临床的典型代表。美罗华因其对于CD20+的B系非何杰金淋巴瘤（Non Hodgkin’s Lymphoma,NHL）有确切的疗效,已被纳入该类淋巴瘤的一线治疗方案中。但CD20分子在B系分化早期表达较少,限制了它在B祖细胞型白血病和部分淋巴瘤中的应用。CD19是B细胞的另一个特异性的表面标记,它在B系细胞表面的持续稳定表达贯穿了B细胞的整个发育过程。因此,CD19分子可作为理想的先导分子用于治疗B细胞性白血病和淋巴瘤。目前,国际上正在研究的抗人CD19单抗有多种,大多数研究结果表明,无论它们是非结合型单抗,还是结合型单抗,动物实验和临床治疗前研究均显示出其在靶向治疗B淋巴细胞系恶性肿瘤方面具有较为理想的效果;同时发现,这些不同克隆的抗人CD19抗体与B系肿瘤细胞的反应性不尽相同,对B系肿瘤细胞的选择性杀伤作用也并非完全一致。更重要的是,到目前为止,临床上尚无如美罗华一样在临床上成功应用的CD19单抗制剂,因此,有必要对更多的CD19克隆进行基因改造和功能研究。本课题拟对本实验室自行研制的、有自主知识产权并经国际鉴定和命名的鼠抗人CD19单抗ZCH-4-2E8（简称2E8）进行改造,基因工程构建杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞Sf9中表达,检测其抗体活性,为该抗体免疫毒素的研制和临床应用以及下一步制备人源化抗体打下基础。杆状病毒表达系统在真核表达系统中应用较为广泛,它具有基因容量大,表达效率高,有表达后修饰,可操作性和生物安全性好的特点。pAc-κ-CH3杆状病毒载体是专为表达抗体而设计的杆状病毒载体,它带有IgGl的重、轻链恒定区（CH、CL）,重、轻链的前导序列（Leader）及可变区VH、VL的插入位点,并据报道抗体表达量高达6-18 mg/L。故本研究选择该系统来表达目的蛋白。材料与方法1、真核分泌型重组杆状病毒穿梭载体pAc-x-CH3-VH2E8-VL2E8的构建:1.1 VH2E8、VL2E8基因的克隆与测序:以本研究室前期研究得到的带有2E8重、轻链可变区序列(VH2E8、VL2E8)的pSectag2A/ScFv2E8质粒作为模板,设计引物通过PCR将XhoⅠ和NheⅠ酶切位点引入VH2E8的两端,SacⅠ和HindⅢ酶切位点引入VL2E8的两端;PCR产物电泳后目的条带切胶回收,纯化后将目的基因片段连接入pGEM?-T easy vector（TA克隆）,转化大肠杆菌DH5α,铺板,挑白色菌落,扩增后抽提质粒酶切鉴定并对其进行测序核实。1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8重组杆状病毒穿梭载体的构建:将测序核实过序列正确的TA-VH2E8和pAc-κ-CH3经XhoⅠ和NheⅠ双酶切处理后通过连接、转化、筛选、扩增、抽提质粒、酶切鉴定等步骤后,测序核实序列正确插入,命名为pAc-κ-CH3-VH2E8,再将TA-VL2E8和pAc-κ-CH3-VH2E8经SacⅠ和HindⅢ双酶切处理后通过连接、转化、筛选、扩增、抽提质粒、酶切鉴定等步骤后,测序核实序列正确插入,从而获得真核分泌型重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8。用Qiagen plasmid purification mini kit抽提转染级纯质粒.2、重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8转染Sf9细胞、扩毒、表达重组抗体:2.1 Sf9细胞、2E8细胞、Nalm-6细胞、High Five细胞的复苏与培养:按照常规方法进行,并进行Sf9和High Five细胞的无血清驯化。2.2重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8转染Sf9细胞:pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8与AcNPV线性DNA共转染Sf9细胞,并设阳性对照和阴性对照各一组。转染后观察细胞形态。4天时收转染阳性对照组细胞显色,验证转染是否成功。7天后收集pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8转染组上清,即为原始重组完整病毒pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV（P0）。收集转染细胞备做鉴定。2.3重组完整病毒pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV感染Sf9细胞,扩毒:以100μl P0感染2×106个Sf9细胞扩增第一代完整病毒pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P1,以50μlP1感染2×106个Sf9细胞扩增第二代完整病毒pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P2,以20μl P2感染2×106个Sf9细胞的比例扩增第三代完整病毒pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3。收各代感染上清作病毒储存液,收集转染细胞制作细胞裂解液备做鉴定。2.4人鼠嵌合型CD19基因工程抗体在Sf9细胞中表达:以MOI（Multiplicity ofInfection,MOI=病毒颗粒数/感染细胞数）约为3-10,无血清培养条件下表达嵌合抗体。感染6天时收集上清和细胞,备作抗体检测。3、重组蛋白的鉴定:3.1细胞免疫荧光法、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western blot初步鉴定重组抗体在感染的Sf9细胞的表达。3.2流式细胞术检测重组抗体活性:3.2.1流式细胞术以间标法检测pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞表达上清中的重组抗体活性:取无血清培养的Sf9细胞的表达上清和未感染Sf9细胞培养上清各60ml,超滤浓缩300倍后,与Naml-6细胞共孵育,通过流式细胞仪观察FITC标记的鼠抗人Fc段（Mouse Anti Human Fc,FITC labelled;MAH-Fc-FITC）和FITC标记的羊抗鼠κ链（Goat Anti Mouseκchain,FITC labelled;GAM-κ-FITC）作用后的阳性细胞,以判断细胞培养上清中是否存在有活性的重组抗体。3.2.2流式细胞术检测pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染Sf9细胞的表达上清对亲本直标单抗2E8的阻滞作用:取Sf9细胞的表达上清和未感染Sf9细胞培养上清各60ml,超滤浓缩至400μl后,以100μl/次,阻滞Naml-6细胞两次。后通过流式细胞仪观察表达上清对亲本直标单抗2E8-FITC的阻滞效果。3.2.3流式细胞术间标法检测pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞裂解液中重组蛋白活性:取感染的Sf9细胞和未感染Sf9细胞制作裂解液,裂解液处理后与Naml-6细胞共孵育,通过流式细胞仪观察MAH-Fc-FITC和GAM-κ-FITC作用后的阳性细胞,以判断细胞裂解液中是否存在有活性的重组抗体。4、改进裂解液配方,增加重组抗体可溶性及抗体的纯化:4.1用水配合超声裂解细胞:取pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞,以2×107个细胞加1ml灭菌双蒸水,加相应的酶抑制剂;超声功率240W开2秒停2秒,共20次,离心后取上清用于下一步检测。4.2配制复性裂解液,加入氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽,去除去垢剂成分,配合超声裂解细胞:取pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞,以2×107个细胞/ml复性裂解液的比例,加入相应的酶抑制剂,配合超声裂解细胞,离心后取上清用于下一步纯化或检测。4.3复性裂解液裂解感染的Sf9细胞后,裂解液过Protein A柱纯化。5、以High Five细胞表达重组抗体:5.1以MOI约为5-10,High Five细胞无血清培养条件下表达嵌合抗体。感染3天收集上清。5.2上清浓缩后以流式细胞术间标法和阻滞法检测抗体活性。方法同3.2。结果1、真核分泌型重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8的构建:1.1 VH2E8,VL2E8基因的扩增、连接入pGEM?—T Easy载体（TA克隆）并测序鉴定:PCR产物电泳可见VH2E8泳道380bp左右条带,VL2E8泳道330bp左右条带,将目的条带切胶回收后连接入TA克隆,扩增后抽提质粒,酶切鉴定可见有380bp、330bp左右条带,送测序鉴定。通过DNASIS MAX trail软件比对测序结果,所得序列与VH2E8、VL2E8理论序列完全一致。1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8重组杆状病毒穿梭载体的构建:pAc-κ-CH3和TA-VH2E8双酶切电泳可见目的条带,切胶回收,连接后酶切鉴定,可见有预期大小的条带,送测序鉴定。比对测序结果,所得序列与VH2E8理论序列完全一致。再以pAc-κ-CH3-VH2E8和TA-VL2E8双酶切电泳可见目的条带,切胶回收,连接后酶切鉴定,可见有预期大小的条带,送测序鉴定。比对测序结果,所得序列与VH2E8、VL2E8理论序列完全一致。真核分泌型重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8构建成功。2、真核分泌型重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8转染Sf9细胞、扩毒、表达重组抗体:2.1杂交瘤细胞复苏后培养状态良好,收集培养上清,得到亲本鼠抗人CD19单抗2E8上清,4℃冰箱保存备用。Sf9和Nalm-6细胞状态良好备用。2.2重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8转染Sf9细胞:转染后观察到细胞大小不一,形态不规则,有少量细胞碎片,细胞停止增殖等感染征象:转染4天后收获阳性对照细胞做显色呈阳性,转染成功,得到原代杆状病毒完整病毒株pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P0。2.3扩增完整的重组病毒pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV:经过三代扩增,100μl PO感染2×106个Sf9细胞扩增第一代重组杆状病毒（P1）,50μl P1感染2×106个Sf9细胞扩增第二代重组杆状病毒（P2）,20μl P2感染2×106个Sf9细胞扩增第二代重组杆状病毒（P3）。随代数增加细胞感染征象出现越早、越明显,提示病毒滴度随代数增加而增高。2.4 pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染Sf9细胞2天,细胞感染征象即很明显,6天时存活细胞约30%（图4）,根据Baculogold transfection kit说明书选择细胞30%存活时收获上清和细胞作检测。3、重组蛋白的鉴定:3.1.1细胞免疫荧光法鉴定转染Sf9细胞内的重组蛋白:Sf9细胞有绿色自发荧光,无红色自发荧光,故选择发红色荧光的罗丹明标记的羊抗鼠Fab段（Goat anti mouseFab,rhodamin labelled;GAM-Fab-Rhodamin）作为二抗,检测pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8转染Sf9细胞7天时收获的细胞,结果见细胞内荧光阳性的细胞占80%左右,而对照组为阴性。3.1.2 SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达:以含血清或无血清培养的Sf9细胞感染pAc-κ-CH3=VH2E8=VL2E8CV P3,表达上清浓缩10倍跑SDS-PAGE,未见与美罗华重、轻链位置相对应条带。同时以感染和未感染Sf9细胞裂解液和感染Sf9细胞裂解沉淀跑SDS-PAGE,可以看到与美罗华重、轻链对应位置的蛋白条带。3.1.3 Western blot鉴定重组蛋白表达:经辣根过氧化物酶标记的抗β-actin抗体（Anti-β-actin-HRP）标记显影证实细胞裂解液制备成功;经预实验选定辣根过氧化物酶标记的鼠抗人Fc段单抗（MAH-Fc-HRP）作为二抗做Western blot检测目的抗体,发现以含血清或无血清培养pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV感染的Sf9细胞,表达上清浓缩10倍检测,均未见与美罗华重、轻链位置相对应条带显影。而感染Sf9细胞裂解液有与美罗华重、轻链位置相对应的条带,未感染Sf9细胞无条带。3.2流式细胞术检测重组蛋白活性。3.2.1流式细胞术间标法检测pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞表达上清中重组抗体:pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞表达上清以间标法未检测到抗体活性。3.2.2流式细胞术检测pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染Sf9细胞的表达上清对亲本直标单抗2E8-FITC的阻滞作用:pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞表达上清中未能检测到具有阻滞效果的同表位抗体活性。3.2.3流式细胞术间标法检测pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞裂解液中重组蛋白活性:GAM-Fab-FITC组加感染的Sf9细胞裂解液后阳性细胞为14.35%（VS 2.97%）;MAH-Fc-FITC组加感染的Sf9细胞裂解液后阳性细胞为28.67%（VS2.76%）,较阴性对照明显增高,提示细胞裂解液中存在有活性的重组抗体。4、改进裂解液配方,增加嵌合抗体可溶性及抗体的纯化4.1以水和超声裂解pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞。4.1.1以水和超声裂解感染的Sf9细胞,裂解上清和沉淀与传统裂解液跑SDS-PAGE:可见在水裂解的细胞裂解液中蛋白条带更淡,但均有与美罗华重、轻链对应的条带。4.1.2以水和超声裂解感染的Sf9细胞,裂解液Western blot显影:可见重组抗体仅有重链条带,没有轻链条带,而阳性对照有重、轻链条带。4.2配制复性裂解液,配合超声裂解pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9细胞4.2.1以复性裂解液,配合超声裂解感染的细胞后,过Protein A柱纯化嵌合抗体:洗脱时仅在pH6.0洗脱液过柱时看到有一个小洗脱峰,pH5.0、4.0、3.2均未见洗脱峰,收集pH6.0洗脱的蛋白,超滤浓缩后备做Western blot和流式细胞术检测。4.2.2收集洗脱液、过柱液,浓缩后与裂解液一起Western blot鉴定:可见洗脱液泳道无条带,裂解液和过柱液泳道有淡条带。5、以High Five细胞表达重组抗体5.1扩大培养High Five细胞并无血清驯化,表达重组抗体。5.2流式细胞术检测重组蛋白活性。5.2.1流式细胞术间标法检测pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的High Five细胞表达上清中重组抗体:pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的High Five细胞表达上清以间标法未检测到抗体活性。5.2.2流式细胞术检测pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染High Five细胞的表达上清对亲本直标单抗2E8-FITC的阻滞作用:pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的High Five细胞表达上清中未能检测到具有阻滞效果的同表位抗体活性。结论1、本研究成功地构建了抗人CD19人鼠嵌合型基因工程抗体的重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8。2、重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8转染Sf9细胞得到有感染性的完整重组杆状病毒株pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV。3、成功地扩增pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV至第三代,得到高滴度的病毒储存液。4、抗人CD19人鼠嵌合型基因工程抗体Hm2E8在Sf9细胞中表达得到了有活性的重组抗体。5、表达的重组抗体大多以沉淀形式存在于细胞内;目前重组抗体在Sf9和High Five细胞中均未能分泌表达。改进裂解液配方、采用超声裂解未能增加Sf9中表达的重组抗体的可溶性。