论文题目: 内毒素与TRAM基因表达的关系及TRAM siRNA对内毒素炎症反应的抑制效应研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 外科学
作者: 陈力勇
导师: 朱佩芳,王正国
关键词: 炎症反应,内毒素,细胞表位,免疫原性
文献来源: 第三军医大学
发表年度: 2005
论文摘要: 脓毒症休克这一最严重的并发症是致命性的,死亡率达35-70%。细菌内毒素或脂多糖是诱导脓毒症或失控性炎症反应的主要因素之一。TLR4 是LPS 的受体,在先天免疫和适应性免疫反应中发挥重要作用。正常情况下,免疫反应精细地调控局部炎症反应。当这种调控机制失常时,全身炎症反应发生,使感染转变成脓毒症或脓毒症休克。尽管对内毒素导致炎症反应的分子机制已进行深入研究,但新的作用机制仍在不断探索。从分子机制上看调控内毒素炎症反应的靶点很多,而要选择一个对机体影响相对较少,又能控制炎症反应发展成失控性炎症反应并具有临床应用前景的靶点却困难重重。近年来, 鉴定的TLR4 细胞内MyD88 非依赖信号转导途径在LPS 脓毒症中扮演重要作用,这为寻找内毒素脓毒症治疗靶点提供了新思路。TRAM 是特异性针对LPS细胞内MyD88 非依赖信号转导接头蛋白,理论上可满足候选条件。因此,本课题选择TRAM基因为研究对象,从以下几方面对内毒素与TRAM基因表达的关系及TRAM siRNA对内毒素炎症反应的抑制效应进行初步探讨。其主要研究方法和结论如下: 1 利用生物息信学技术的蛋白质预测软件对TRAM蛋白的二级结构和B细胞表位进行了分析和预测,结果显示其最可能的优势B细胞表位于TRAM分子N-末端第216-229位之间,氨基酸序列为QSIWK ETRSVSQKQ。2 通过人工合成该氨基酸序列,免疫新西兰大白兔,制备了兔抗小鼠TRAM 蛋白多克隆抗体,并通过ELISA、细胞免疫化学染色及Western blot 检测证实该多克隆抗体具有较高的特异性免疫原性,为后续研究准备了实验工具。3 设计针对TRAM 基因的特异性引物,经RT-PCR 扩增特异性的TRAM 基因cDNA片段,连接至pGEM?-T 载体,转化入大肠杆菌DH5α,重组pGME?-T 载体经酶切和测序检测证实成功。这样构建了荧光定量PCR 检测TRAM 基因mRNA 表达的外标准品。4 采用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术检测LPS 刺激小鼠RAW264.7 细胞对TRAM基因表达mRNA 的影响,结果显示:在小鼠RAW264.7 细胞中TRAM 基因正常表
论文目录:
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论文正文 内毒素与TRAM 基因表达的关系及TRAM siRNA 对内毒素炎症反应的抑制效应研究
前言
参考文献
第一部分 IRAM 抗体的设计、多肽合成、多克隆抗体制备及鉴定
实验一 TRAM 抗体的设计
材料与方法
结果与分析
讨论
实验二 鼠 TFRAM 多肽的合成和纯度鉴定
材料与方法
结果
讨论
实验三 兔抗鼠 TFRAM 多克隆抗体的制备及其免疫原性检测
材料与方法
结果
讨论
参考文献
第二部分 内毒素对 TRAM 基因表达的作用
实验一 重组pGEMR-T 载体的构建和鉴定
材料与方法
结果与分析
讨论
实验二 内毒素刺激对 TFRAM 基因表达的影响
材料与方法
结果
讨论
参考文献
第三部分 TRAM siRNA 对内毒素炎症反应的抑制效应
实验一 TRAM 基因siRNA 表达载体的构建和功能鉴定
材料与方法
结果
讨论
实验二 TRAM siIRA 对内毒素炎症反应的抑制效应
材料与方法
结果
讨论
参考文献
全文总结
致谢
照片
文献综述 TLR 对病原体的识别及其细胞内信号转导途径
参考文献
学习期间发表论文
发布时间: 2005-11-08
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