单个活细胞多功能高灵敏实时荧光显微成像研究

论文摘要

单个活细胞实时检测具有重要的理论意义和实际应用价值,荧光显微成像技术因灵敏度高、特异性好、易实现“可视化”而成为该领域最具发展潜力的方法。然而由于活细胞样品的复杂性,真正适用的方法仍面临挑战。本论文着力搭建一套适用于单个活细胞实时检测和生物单分子研究的多功能、高灵敏、实时荧光显微成像系统,并探索该系统在具体生命科学问题中的应用。首先,搭建了一套多功能高灵敏实时荧光显微成像系统,并发展相关图像处理方法。利用像增强型CCD实现了实时荧光成像,灵敏度高、速度快、对细胞光损伤小,适合于实时检测活细胞内分子、离子分布和变化;实现了物镜型全内反射荧光成像,提高纵向分辨率、图像信噪比和灵敏度,适合于实时追踪细胞膜附近单分子动态过程;实现了荧光共振能量转移成像,分辨率突破衍射极限达到纳米量级,适合于研究活细胞内分子相互作用或构象变化;扩展了荧光比率、双标记双/三通道、荧光+微分干涉相差、三维层切等多种活细胞实时成像功能。各功能可单独或联合使用,为生命科学研究提供多种先进技术手段。其次,以胸腺细胞凋亡研究为例探索了该系统的具体应用,并发展相关量化分析方法。首次在单个活细胞水平实时记录了亚硝基谷胱甘肽诱导胸腺细胞凋亡的启动过程,并确定启动时间点;实时记录了不同抑制剂的协作过程,并提示不同的作用机理;实时记录并量化分析了诱导凋亡时细胞质酸化、游离钙离子水平迅速升高和线粒体跨膜电位逐渐丧失的过程,结果揭示了一定的规律性,为凋亡信号转导通路的研究提供了重要线索。此外,以建立的系统为平台开展生物单分子成像基础研究,优化了实验条件,并发展相关数据分析方法,为活细胞内生物单分子研究打下基础。清晰记录了单个拉直的DNA分子,并为长时间成像优化实验条件;实时记录了单个纳米粒子的运动轨迹,并进行三维追踪,分析其轨迹得到与理论计算吻合的受限布朗运动扩散系数;记录了量子点和荧光分子的荧光共振能量转移现象。本论文的研究将促进荧光显微成像技术在活细胞生命过程研究的应用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 选题背景
• 1.1.1 生命科学研究中物理学方法和技术的重要性
• 1.1.2 单个活细胞实时检测的重要性、特点和要求
• 1.2 活细胞荧光显微成像研究进展
• 1.2.1 荧光显微成像研究进展及其活细胞应用
• 1.2.2 活细胞荧光标记技术研究进展
• 1.3 论文工作目标与任务
• 第2章 多功能高灵敏实时荧光显微成像系统的搭建
• 2.1 本章引论
• 2.2 基于像增强型电荷耦合器件的实时荧光显微成像系统
• 2.2.1 实时荧光显微成像系统的组成
• 2.2.2 实时荧光显微成像系统的性能特点
• 2.3 全内反射荧光成像技术
• 2.3.1 全内反射荧光成像原理
• 2.3.2 全内反射荧光成像功能的实现
• 2.4 荧光共振能量转移成像方法
• 2.4.1 荧光共振能量转移原理
• 2.4.2 荧光共振能量转移成像功能的实现
• 2.5 成像系统功能的进一步扩展
• 2.5.1 基于荧光比率法的定量实时检测
• 2.5.1.1 双激发单发射荧光比率
• 2.5.1.2 单激发双发射荧光比率
• 2.5.2 基于荧光探针双标记的多参数实时检测
• 2.5.2.1 双标记双通道荧光成像
• 2.5.2.2 双标记三通道荧光成像
• 2.5.3 荧光与微分干涉相差信号的同时实时检测
• 2.5.4 三维层切成像技术
• 2.6 活细胞实时观察平台
• 2.6.1 搭建活细胞实时观察平台的目的
• 2.6.2 活细胞实时观察平台的组成
• 2.7 本章小结
• 第3章 胸腺细胞凋亡的单细胞实时研究
• 3.1 本章引论
• 3.2 单个活细胞凋亡启动过程的实时成像
• 3.2.1 实验方法
• 3.2.2 结果与讨论
• 3.3 亚硝基谷胱甘肽诱导胸腺细胞凋亡时细胞内的实时变化
• 3.3.1 凋亡与细胞内pH 值变化
• 3.3.1.1 实验方法Ⅰ：单标记比率法
• 3.3.1.2 结果与讨论Ⅰ
• 3.3.1.3 实验方法Ⅱ：双标记三通道
• 3.3.1.4 结果与讨论Ⅱ
• 3.3.2 凋亡与细胞内游离钙离子浓度变化
• 3.3.2.1 实验方法
• 3.3.2.2 结果与讨论
• 3.3.3 凋亡与线粒体跨膜电位变化
• 3.3.3.1 实验方法
• 3.3.3.2 结果与讨论
• 3.4 本章小结
• 第4章 生物单分子成像基础研究
• 4.1 本章引论
• 4.2 单个DNA 分子的全内反射荧光成像
• 4.2.1 实验方法
• 4.2.2 结果与讨论
• 4.3 单粒子布朗运动的三维追踪和轨迹分析
• 4.3.1 实验方法
• 4.3.2 结果与讨论
• 4.4 基于量子点的荧光共振能量转移成像
• 4.4.1 实验方法
• 4.4.2 结果与讨论
• 4.5 本章小结
• 第5章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果