鼓泡塔生物反应器中悬浮培养红豆杉细胞的防御应答

论文摘要

为了研究悬浮培养的红豆杉细胞对鼓泡引起的流体剪切环境的防御应答机制,通过对三种不同鼓泡孔径的反应器的湍动剪切力进行定量分析,探讨了鼓泡引起的红豆杉细胞基因转录、蛋白酶表达以及磷脂代谢水平上的变化,试图为工程化放大研究提供一些理论依据。采用激光多普勒测速方法,分别对3个不同鼓泡孔径（1.0mm、1.5mm和2.0mm）的反应器内的湍动剪切力进行了研究。通过计算比较反应器不同区域的湍动剪切力场,发现轴向雷诺应力最大,其数值在2.0 N/m2到7.2 N/m2之间;反应器内三个区域的湍动剪切力的大小顺序为:气液界面处>鼓泡通气口以下>鼓泡塔主体区域;对比3个不同鼓泡孔径的反应器发现,靠近气液界面处湍动剪切力随着鼓泡孔径的减小而增大。从流体剪切力的角度证实了气液界面是细胞损伤的主要区域,而且小鼓泡孔径引起的流体湍动程度最强。运用RT-PCR方法,探讨了鼓泡对紫杉醇合成相关的3个基因（hmgr、dxr和ts）的转录水平的影响。在短期培养过程中,与摇瓶培养的细胞相比,鼓泡塔中hmgr和dxr基因的转录水平分别降低了53.1%, 41.5%（1.5mm鼓泡孔径）和64.2%, 53.8%（1.0mm鼓泡孔径）,ts基因没有显著变化;在长期培养过程中,3个基因的转录水平在培养的6-11天,转录水平迅速增加,以后逐渐降低,hmgr在第11天的转录活性分别达到了摇瓶的1.59倍（1.5mm鼓泡孔径）和1.31倍（1.0mm鼓泡孔径）,同时期dxr的转录活性分别为摇瓶的1.51倍（1.5mm鼓泡孔径）和1.31倍（1.0mm鼓泡孔径）,ts的转录活性分别为摇瓶的1.47倍（1.5mm鼓泡孔径）和1.26倍（1.0mm鼓泡孔径）。研究了鼓泡孔径分别为1.0mm和1.5mm的反应器中剪切环境胁迫下引起的细胞防御应答。结果表明,反应器中细胞在8h后产生活性氧的迸发,随后在11h后NO浓度达到高峰,PAL酶活与LOX酶活分别在16h和20h达到最大值,说明活性氧、NO、PAL和LOX都参与了细胞对机械环境的应答。与1.5mm鼓泡孔径的反应器相比,1.0mm鼓泡孔径反应器中细胞在活性氧、NO、PAL酶活以及LOX酶活水平都高,说明细胞在小鼓泡孔径引起的剪切环境胁迫下的防御应答反应更为明显。运用液质联用技术（LC/ESI-MS）,分析了1.0mm和1.5mm鼓泡孔径的反应器与摇瓶培养的红豆杉细胞在磷脂代谢水平上的差异。对提取的33个磷脂样本进行了主成分分析,发现摇瓶培养与鼓泡塔反应器培养48h的细胞可由第一主成分和第二主成分进行很好的聚类,反应器培养96h的样本与摇瓶样本的聚类距离更远;对潜在的生物标志物进行了二级质谱扫描,确定了这些磷脂的分子结构,主要有11种PA磷脂分子和4种PC磷脂分子,与摇瓶培养相比,反应器培养中部分磷脂PC含量明显降低,而PA含量则明显增加;小的鼓泡孔径引起的磷脂代谢水平差异更加明显,而PA的增加被证明与红豆杉细胞中次生代谢产物紫杉醇的增加有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物细胞培养的工程化
• 1.1.1 植物细胞大规模培养的现状
• 1.1.2 植物细胞培养的工程科学问题
• 1.2 鼓泡塔生物反应器中细胞对微环境的响应
• 1.2.1 植物细胞培养的生物反应器
• 1.2.2 鼓泡塔生物反应器的特点
• 1.2.3 鼓泡塔内流体力学研究
• 1.2.4 鼓泡塔反应器内细胞－气泡相互作用
• 1.2.5 鼓泡塔反应器内细胞损伤及其保护机理
• 1.3 植物细胞对机械胁迫的生理应答
• 1.3.1 活性氧与机械胁迫
• 1.3.2 一氧化氮与机械胁迫
• 1.3.3 基因表达与机械胁迫
• 1.4 脂质组学研究
• 1.5 本论文的研究意义和主要研究内容
• 第二章 激光多普勒测速方法对鼓泡塔反应器内的流体湍动剪切力的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 培养基密度与粘度测定
• 2.2.2 鼓泡塔生物反应器实验装置
• 2.2.3 激光多普勒测速（LDA）实验装置
• 2.2.4 测量节点选取
• 2.3 流体剪切理论
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 液相速度随时间的波动
• 2.4.2 测量结果的坐标转换
• 2.4.3 雷诺应力（Reynolds stress）的计算
• 2.4.4 不同截面雷诺应力场的分布
• 2.4.5 不同鼓泡孔径反应器内雷诺应力场的分布
• 2.5 小结
• 第三章 鼓泡对反应器内东北红豆杉细胞生长的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 主要试剂与药品
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.2.3 细胞株系及其培养
• 3.2.4 生物反应器装置
• 3.2.5 体积氧传递系数KLa 的测定
• 3.2.6 细胞生物量的测定
• 3.2.7 胞外蔗糖含量的测定
• 3.2.8 胞外可溶性磷含量的测定
• 3.2.9 细胞活力的测定
• 3.2.10 细胞膜通透性的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 不同鼓泡孔径对体积氧传递系数KLa 的影响
• 3.3.2 不同鼓泡孔径对红豆杉细胞生长的影响
• 3.3.3 培养体积对红豆杉细胞生长的影响
• 3.3.4 PF-68 对红豆杉细胞损伤的保护
• 3.4 小结
• 第四章 RT-PCR 研究鼓泡塔反应器中紫杉醇合成途径相关基因的转录水平
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 主要试剂与药品
• 4.2.2 主要仪器设备
• 4.2.3 细胞株系及其培养
• 4.2.4 生物反应器装置
• 4.2.5 总RNA 提取
• 4.2.6 引物设计
• 4.2.7 普通RT-PCR 及产物测序
• 4.2.8 第一链cDNA 合成
• 4.2.9 实时荧光PCR
• 4.2.10 mRNA 的相对定量
• 4.2.11 琼脂糖凝胶电泳
• 4.2.12 细胞线粒体活性的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 HMGR 基因的cDNA 克隆及分析
• 4.3.2 RT-PCR 产物分析
• 4.3.3 反应器培养与摇瓶培养下红豆杉细胞基因表达水平差异
• 4.3.4 不同鼓泡孔径的反应器内基因表达水平
• 4.4 小结
• 第五章 鼓泡塔反应器中细胞活性氧、PAL 酶以及LOX 酶的研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与方法
• 5.2.1 主要试剂与药品
• 5.2.2 主要仪器设备
• 5.2.3 细胞株系及其培养
• 5.2.4 生物反应器装置
• 5.2.5 蛋白含量的测定
• 5.2.6 活性氧（ROS）含量测定
• 5.2.7 NO 含量测定
• 5.2.8 PAL 酶活的测定
• 5.2.9 LOX 酶活的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 鼓泡塔反应器内机械胁迫下活性氧（ROS）的产生
• 5.3.2 鼓泡塔反应器内机械胁迫下一氧化氮（NO）的产生
• 5.3.3 鼓泡塔反应器内机械胁迫下PAL 酶活的变化
• 5.3.4 鼓泡塔反应器内机械胁迫下LOX 酶活的变化
• 5.4 小结
• 第六章 鼓泡塔反应器培养与摇瓶培养的细胞磷脂代谢差异
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料与方法
• 6.2.1 主要试剂与药品
• 6.2.2 主要仪器设备
• 6.2.3 细胞株系及其培养
• 6.2.4 生物反应器装置
• 6.2.5 HPLC/ESI-MS 条件
• 6.2.6 红豆杉细胞磷脂的提取
• 6.2.7 多元统计分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 东北红豆杉细胞的磷脂图谱
• 6.3.2 反应器培养与摇瓶培养的细胞磷脂差异分析
• 6.3.3 磷脂信号分子与其他信号分子的相互关系
• 6.4 小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 附录一 Visual basic 程序
• 致谢