论文摘要
目的:1.建立一套高效的无血清体外制备DCs疫苗的方法,为DCs疫苗的临床应用提供实验依据。2.探讨DCs对CIK增殖和杀伤肝癌细胞的影响。方法:1.采集脐血,分离其中的单个核细胞,用无血清DCs培养基（SFM）/含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基（SM）,并添加rhGM-CSF、rhIL-4联合诱导单个核细胞分化为未成熟DCs,第5天添加肝癌细胞冻融抗原,TNF-α等促成熟因子,第7天收获成熟DCs,以倒置显微镜观察DCs的细胞形态,流式细胞仪测定Des表面标志物的表达;并从细胞形态和表面标志物等方面比较用无血清DCs培养基（SFM）/含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基（SM）培养的DCs。2.用细胞因子γ-IFN、IL-2、CD3-Ab、IL-1a诱导脐血单个核细胞为CIK,第7天DCs和CIK共同培养。采用MTT法测定无血清培养基和含5%胎牛血清的培养基产生的DCs刺激CIK的促增殖效应和DC-CIK对肝癌细胞的杀伤效应。结果:1.无论采用无血清树突状细胞培养基（SFM）还是含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基,脐血来源的单核细胞在细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α的诱导下,并负载7721肝癌细胞冻融抗原后,均能分化成为具有典型形态和表型的成熟DCs,流式结果显示:采用无血清培养基培养的DCs表面标志物表达水平为（%）:CD1a 56.6±3.8、CD11c 64.5±4.3、CD14 19.5±1.8、CD4077.8±7.5、CD83 70.8±5.1、CD86 76.5±6.3、HLA-DR 91.5±3.5;采用5%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养的SM-DC表面标志物表达水平为（%）:CD1a 59.3±5.1、CD11c 59.6±6.2、CD14 20.1±2.2、CD40 75.6±6.4、CD83 65.2±4.4、CD8680.4±6.9、HLA-DR 94.5±2.8;两组DCs的表面标志均无差别,（P＞0.05）。2.混合淋巴细胞反应结果:DCs刺激CIK的刺激指数为:无血清DCs培养基组2.01±0.22,含血清培养基DCs组2.31±0.24;统计分析表明:不同培养基培养的DCs,在促进淋巴细胞增殖作用中无差别,均能有效地刺激CIK增殖,（P＞0.05）。3.杀伤实验结果:DCs激活CIK对肝癌细胞的杀伤率为（%）:无血清DCs培养基组SFMDC-CIK 74.5±7.5,含血清培养基组SMDC-CIK 77.9±6.0,单一CIK 54.1±4.9,统计分析表明:①SM-DC和SFM-DC激活的CIK对肝癌细胞的杀伤率无明显差别,（P＞0.05）;②SM-DC和SFM-DC激活的CIK对肝癌细胞的杀伤率均高于未被DCs激活的CIK,（P＜0.05）。结论:1.我们初步建立了一套体外无血清制备DCs的方法;无血清树突状细胞培养基在添加细胞因子rhGM-CSF 100ng/ml、rhIL-4、50ng/ml、TNF-α50ng/ml及肝癌抗原后,能够诱导脐血单个核细胞分化为具有典型形态和高度表达DCs表面标志的成熟树突状细胞。2.SM-DC和SFM-DC均能有效地刺激CIK增殖及提高其抗肿瘤作用,DC-CIK治疗肿瘤将具有良好的应用前景。
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