纺锤体检查点蛋白BubR1和Cenp-E与肝癌细胞染色体数目异常的关系

论文摘要

目的:研究纺锤体检查点（spindle checkpoint,SCP）蛋白BubR1和Cenp-E在癌组织和正常肝组织表达差异,利用间接免疫荧光技术与RNAi技术在肝癌细胞系（HepG-2）和正常肝细胞系（LO2）中进一步研究SCP基因BubR1和Cenp-E在肝癌细胞中的定位和作用。为进一步阐明肝癌细胞染色体数目异常的机理奠定基础。方法:1.用FQ-PCR和Western-blot,间接免疫荧光来检测SCP基因BubR1和Cenp-E在肝癌组织和正常肝组织基因和蛋白的表达情况。2.用染色体分析技术分析人类肝癌细胞系（HepG-2）和人类正常肝细胞系（LO2）染色体数目异常情况。3.用Nocodazole（诺考达唑）同时处理HepG-2细胞和LO2细胞使两种细胞高度同步在分裂期,流式细胞仪测定处理前后的HepG-2细胞和LO2细胞同步在分裂期情况。4.利用FQ-PCR和Western-blot检测BubR1和Cenp-E基因在两种同步化的细胞mRNA和蛋白的表达水平。5.间接免疫荧光技术观察Cenp-E蛋白在两种细胞中的定位及表达。6.在LO2细胞中用RNAi技术干扰Cenp-E基因后,用FQ-PCR和Western-blot检测BubR1和Cenp-E基因在干扰前后mRNA和蛋白的表达水平。并利用MTT,间接免疫荧光进一步评价干扰后的细胞功能情况。结果:1.FQ-PCR和Western-blot,间接免疫荧光检测BubR1、Cenp-E基因在肝癌组织和正常肝组织表达,发现BubR1和Cenp-E在正常肝组织的表达明显高于肝癌组织,差异有统计学意义。2.染色体分析发现HepG-2细胞染色体数目异常程度明显高于LO2细胞,差异具有统计学意义。3.用流式细胞仪检测用Nocodazole处理前后的HepG-2细胞和LO2细胞发现处理前两种细胞G2-M期的比例差异不显著。处理后两种细胞的G2-M期细胞都大幅增加,但两组细胞中期细胞比例差异不显著。4.FQ-PCR和Western-blot结果显示, Nocodazole处理前BubR1和C-E基因和蛋白在LO2和HepG-2细胞中表达无显著差异,处理后BubR1和Cenp-E基因和蛋白在两种细胞表达都增高,但LO2细胞上调水平大于HepG-2细胞,差异具有统计学意义。5.间接免疫荧光结果显示Cenp-E蛋白主要定位细胞核内,并且在出现异常分裂的细胞核内Cenp-E蛋白的表达明显低于正常分裂的细胞核。6.在干扰Cenp-E后,MTT显示LO2细胞的生长明显减慢。间接免疫荧光显示干扰后的LO2细胞中出现核异常比例明显高于正常细胞。结论:BubR1和Cenp-E在正常肝组织的表达明显高于肝癌组织。BubR1和Cenp-E但LO2细胞应激上调水平大于HepG-2细胞,在LO2细胞干扰Cenp-E基因以后发现细胞增殖受到抑制。BubR1和Cenp-E过低表达可能是肝癌细胞染色体数目异常重要原因之一。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 纺锤体检查点蛋白BubR1 和Cenp-E 在肝癌组织和正常肝组织中的表达
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二部分 Cenp-E 蛋白在HepG-2 细胞和LO2 细胞中的应激表达
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三部分 BbuR1 蛋白在HepG-2 细胞和LO2 细胞分裂期的应激表达
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第四部分 RNAi 干扰抑制Cenp-E 蛋白在LO2 细胞中的表达
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述：纺锤体检查点（spindle checkpoint）的研究进展
• 致谢
• 攻读学位期间发表的文章