逆转录病毒介导的RNA干扰技术的建立及其在抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因表达中的应用

2020-11-23阅读(738)

论文摘要

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是通过内、外源双链RNA触发同源性mRNA的降解，从而使该基因表达沉默（gene silence）的过程。此现象已在多种不同的生物体中被发现。这一过程的主要媒介是由Dicer酶剪切长dsRNA而形成的21-23碱基的小干扰RNA分子（Small interference RNAs，siRNAs）。虽然siRNAs的产生可采用不同的方法，但siRNAs进入细胞都必须依赖转染试剂，很难在细胞内对某种基因形成稳定的长期的抑制效果。因此必须发展更有效的使siRNA进入细胞的运载系统。逆转录病毒载体具有高效转导、稳定整合和无免疫原性等优点而被广泛应用于基因治疗的研究。在包装病毒时所利用的疱疹口炎病毒G（VSV-G），可以提供包膜蛋白，有助于所包装的逆转录病毒识别一种在所有细胞上都存在的磷脂，理论上能有效感染所有有丝分裂的细胞，使得逆转录病毒表达系统得以广泛应用。所以通过把RNA干扰技术和逆转录病毒表达系统相结合，探索可有效转染细胞并稳定表达siRNA的RNAi方法，有十分重要的意义。乙型肝炎病毒（HBV）感染会引起慢性乙型肝炎并并导致肝硬化、肝癌，所以乙型肝炎病毒感染是严重危害人类健康的一种重大疾病，预防和治疗乙型肝炎病毒感染正如治疗HIV感染一样，已经成为世界性难题，有关的治疗方法不断涌现，但尚未有一种可以彻底清除感染病人体内HBV的方法。目前针对乙型肝炎病毒（HBV）的抗体药物、基因疗法等新的特异性疗法是抗HBV的研究热点。特别RNAi现象的发现和RNAi技术的逐渐成熟，使这些一直难以解决的病毒性疾病的治疗与预防出现转机，对肝炎的RNAi研究正方兴未艾。但近几年有关乙肝的研究中所用的化学合成、体外转录合成、质粒载体介导表达的siRNA，都要借助于物理方法和细胞转染手段才能将其导入细胞，限制了其干扰效率和在活体中的应用，因此寻找更加稳定可靠的干扰方法势在必行。本研究建立了一种逆转录病毒介导的能在细胞内稳定表达siRNA的RNA干扰技术。首先构建出靶向p53基因的H1-sip53的表达盒，将其分别克隆到病毒载体pXSN和pXRN中，构建融合逆转录病毒分子，在GP-293细胞中包装成病毒颗粒后感染HepG2细胞，并挑取G418抗性的单克隆细胞。Western印迹检测结果显示：与对照组细胞相比，整合了H1-sip53的HepG2单克隆细胞中，p53基因的表达被特异性抑制，并且这种抑制可以持续至少2个月。结果还显示，融合载体pXSN比pXRN更加有效和稳定。用pBabe-puro构建的融合病毒对以上单克隆细胞进行第2次转染，用Puro抗生素再次筛选细胞，结果表明，2次转染的细胞中的p53基因表达抑制更加强烈，说明此RNAi系统的抑制效率是siRNA拷贝数依赖性的。本实验还通过real time PCR证明，用逆转录病毒表这载体在细胞内表达19 nt的siRNA并不会激活抗病毒的干扰素途径。以上结果表明，本研究所建立的高效特异的逆转录病毒介导的RNA干扰技术，可以将siRNA表达盒稳定整合到细胞的基因组中，从而实现对靶向基因表达的长期稳定抑制。为研究上述RNAi方法对HBV的作用效率，我们选择了靶向HBsAg区的2个siHBV，利用上述建立的RNA干扰技术，构建逆转录病毒介导的可以在HepG2和HepG2．2．15细胞中稳定持续表达siHBV1和siHBV2的RNAi系统。首先构建U6-siHBV表达盒，并将此表达盒分别克隆到病毒载体pXSN、pXRN和pBabe-puro中，构建融合逆转录病毒载体，在GP-293细胞中包装成融合逆转录病毒。用融合病毒pXSN-U6-siHBV和pXRN-U6-siHBV分别感染HepG2细胞，筛选G418抗性细胞。用可以表达HBV相关蛋白的Topo-HBV载体转染抗G418的HepG2细胞。ELISA检测结果显示，pXSN-U6-siHBV1、pXSN-U6-siHBV2、pXRN-U6-siHBV1和pXRN-U6-siHBV2对HBsAg和HBeAg的抑制水平都在93％以上。Northern杂交检测显示，HBV的3.5Kb和2.4Kb／2.1Kb mRNA也被明显降解。表明此RNAi系统可以有效特异的干扰外源性HBV基因的表达。包装后的pBabe-U6-siHBV转染可持续进行HBV复制的HepG2．2．15细胞，挑取Puro抗性细胞。ELISA检测显示，pBabe-U6-siHBV1和pBabe-U6-siHBV1对HepG2．2．15细胞中HBsAg和HBeAg抑制水平都在88％以上，并且转染2个月后，蛋白表达仍被明显抑制。Northern杂交检测显示，HBV mRNA水平明显降低。荧光定量PCR检测结果显示，培养细胞中HBV DNA水平分别下降了3.7倍和3.3倍。表明此RNAi系统可以有效并长期地抑制可在细胞中持续复制的内源性的HBV基因。由于小分子RNA的稳定性差、半寿期短、细胞内转染效率低和靶向性差等问题仍是实际应用的障碍，因此，为提高RNA oligos的稳定性，我们对RNA进行了2’-O-甲基和3’-丙醇基联合修饰，并应用MTT法和流式细胞术及组织病理学分析等在细胞水平和动物水平检测其分布、药动学和毒性等，从而了解其安全性，为临床应用提供科学资料。结果表明，这些RNA oligos在体内广泛分布并且无毒副作用。进一步证明小分子RNA作为基因疗法应用于临床的可行性。总之，本研究建立了逆转录病毒介导的高效特异的RNA干扰技术，并有效用于对HBV的干扰研究。此项技术为通过长期稳定高效的干扰作用研究感兴趣的基因提供了可靠手段。

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英文摘要

第一章逆转录病毒介导的RNA干扰技术的建立

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 细胞系

2.1.4 DNA oligos序列

2.1.5 PCR引物序列

2.1.6 主要试剂及试剂盒

2.1.7 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 DNA oligos的退火处理

2.2.2 质粒的构建

2.2.3 细胞培养

2.2.4 病毒包装与转导

2.2.5 Western blotting检测蛋白的表达水平

2.2.6 荧光定量PCR（real time PCR）

3 结果

3.1 逆转录病毒介导的靶向P53基因的RNA干扰实验流程

3.2 融合逆转录病毒载体的构建

3.3 单克隆抗性细胞库的建立

3.4 单克隆抗性细胞中P53基因表达的Western印迹分析

3.5 二次转染细胞中P53基因表达的Western印迹分析

3.6 二次转染细胞中多腺苷酸合成酶1（OAS1）基因的表达

4 讨论

4.1 逆转录病毒介导体系易于导入细胞和筛选稳定克隆

4.2 逆转录病毒载体介导的RNA干扰体系具有特异性、高效性和稳定性

4.3 逆转录病毒介导的RNA干扰不会引起抗病毒防御机制

4.4 逆转录病毒介导的RNA干扰技术应用前景广阔

参考文献

第二章逆转录病毒介导的RNA干扰对HepG2细胞中HBV基因表达的抑制作用

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒、细胞系

2.1.2 DNA oligos序列的设计与合成

2.1.3 PCR引物序列

2.1.4 主要试剂及试剂盒

2.1.5 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 DNA oligos的退火处理

2.2.2 质粒的构建

2.2.3 细胞培养

2.2.4 病毒包装与转导

2.2.5 检测HepG2细胞中表达盒整合情况

2.2.6 用topo-HBV质粒转染HepG2细胞

2.2.7 ELISA法分析HepG2细胞上清中HBsAg和HBeAg水平

2.2.8 Northern blot分析HepG2细胞中HBV mRNA水平

3 结果

3.1 逆转录病毒介导的靶向HBV基因的RNA干扰实验流程

3.2 SIRNA的设计

3.3 融合逆转录病毒载体的构建

3.4 抗性细胞库的形成及U6-siRNA表达盒的整合情况检测

3.5 HepG2细胞中HBsAg和HBeAg蛋白质量分析

3.6 HepG2细胞中HBV mRNA量的分析

4 讨论

参考文献

第三章逆转录病毒介导的RNA干扰对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和复制的抑制

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒和细胞系

2.1.2 PCR引物、DNA oligos、主要试剂及试剂盒、主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 病毒包装与转导

2.2.3 检测2215细胞中表达盒整合情况

2.2.4 ELISA法分析2215细胞培养基中ImsAg和HBeAg水平

2.2.5 Northern blot分析2215细胞中HBV mRNA水平

2.2.6 荧光定量PCR分析2215细胞上清中HBV DNA水平

3 结果

3.1 融合逆转录病毒载体的构建

3.2 抗性细胞库的建立及鉴定

3.3 HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg的表达水平分析

3.4 HepG2.2.15细胞中HBV mRNA水平分析

3.5 HepG2.2.15细胞中HBV DNA水平分析

4 讨论

参考文献

第四章修饰性RNA寡核苷酸毒性分析

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 RNA oligos

2.1.2 细胞系

2.1.3 动物

2.1.4 主要试剂

2.1.5 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 细胞毒性分析

2.2.3 动物毒性分析

2.2.4 组织病理学分析

2.2.5 cm-RNA oligos在动物组织器官中的分布分析

3 结果

3.1 小分子RNA的安全性检测实验流程

3.2 细胞毒性分析

3.3 动物毒性分析

3.4 组织病理学分析

3.5 荧光标记的cm-RNAoligos在动物不同组织器官中的分布

4 讨论

参考文献

文献综述 RNA干扰技术及其应用

RNA干扰技术及其应用

摘要

1 RNA干扰过程概述

2 RNA干扰机制研究

2.1 内源性的mRNA是dsRNA作用的靶位点

2.2 Dicer:RNA干扰的启动器

2.3 RdRp:RNA干扰的催化剂

2.4 RISC（RNA-induced silencing complex）:干扰效应器复合物

2.5 Argonaute:接头蛋白（Adaptor）

2.6 siRNA（Small interference RNA）

3 哺乳动物细胞中实现RNA干扰的研究历程

4 实现RNA干扰的技术路线

4.1 siRNA分子的设计

4.2 siRNA分子的制备

4.3 转染细胞和个体的方法

4.4 分析RNAt的效果

5 RNAi在生物学和医学研究中的应用

5.1 RNAi与基因功能研究

5.2 RNAi与基因治疗

5.2.1 RNAi与病毒感染的抑制

5.2.2 RNAi与抗肿瘤治疗

5.2.3 RNAi与神经退行性疾病

5.3 RNAi与信号传导通路

5.4 RNA干扰与发育调控

6 展望

参考文献

英文名词及缩写

致谢

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逆转录病毒介导的RNA干扰技术的建立及其在抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因表达中的应用

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