新一代聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶基础研究

论文摘要

目的:原发性肝癌细胞是精氨酸营养缺陷型细胞,精氨酸脱亚胺酶（argininedeiminase,ADI）可分解精氨酸,使肝癌细胞失去营养供给而死亡,却不影响正常细胞的生长。本课题拟研制新一代聚乙二醇（PEG）修饰的ADI,并完成该药物生物学特性的基础研究。方法:采用了全基因合成的方式,以大肠杆菌偏爱的密码子来设计并合成ADI的全基因。构建原核表达载体pET3a-ADI,转化大肠杆菌BL21DE3（pLyss）,筛选阳性克隆IPTG诱导发酵4小时。发酵液离心,收集菌体,高压匀浆破碎后离心。用PBS洗涤包涵体,包涵体增溶复性后,经阴离子交换层析,疏水层析和精氨酸亲和层析法纯化目标蛋白。采用体外精氨酸降解试验测定酶的活性。控制PEG修饰基本反应条件,以新一代PEG修饰技术修饰rADI,修饰后的产物PEG-rADI用疏水柱Resource PHE纯化。用Fe（SCN）,法测定PEG修饰率。活性测定方法与rADI的一致。分别用体外肝癌细胞抑制试验、H22移植瘤模型药效试验、正常鼠免疫原性试验完成PEG-rADI的动物体内、外生物学实验。结果:成功构建了原核表达载体pET3a-ADI,通过改进发酵工艺,增加目标蛋白的百分表达率。优化ADI发酵产物的包涵体复性工艺,使复性收率提高到40%以上。活性测定表明,纯化后rADI的比活性达到40IU/mg。新一代PEG修饰的ADI降低了ADI的免疫原性,其酶活力与其修饰率有关。动物体内、体外生物学预实验结果表明:抑瘤效果与美国凤凰制药公司研制的PEG-ADI20相似,但是重复使用后其免疫原性更低。结论:成功研制了新一代PEG修饰的ADI,并证实其对肝癌细胞有确定的抑制作用。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 2 实验材料和设备
• 2.1 所用的实验材料
• 2.2 实验设备
• 3 实验方法
• 3.1 rADI工程菌构建与发酵
• 3.2 rADI的复性和纯化
• 3.3 rADI的酶活性测定
• 3.4 rADI的PEG修饰基本反应条件和产物制备鉴定
• 3.5 ADI鼠抗体的制备
• 3.6 PEG-rADI的动物体内、外生物学实验
• 4 实验结果
• 4.1 rADI工程菌构建与发酵
• 4.2 rADI的复性和纯化
• 4.3 分子量鉴定
• 4.4 PEG修饰率和酶活性的测定
• 4.5 PEG-rADI的动物体内、外生物学预实验
• 5 结论与讨论
• 参考文献
• 附录
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果