论文摘要
胚胎干细胞（Embryonic Stem cell, ES cell）是从早期动物胚胎的内细胞团（Inner Cell Mass,ICM）或原始生殖细胞（Primordial Germ cells,PGCs）经体外分离、抑制培养,在传代过程中筛选出来的能在体外永久培养的,具有发育全能性的细胞系。动物ES细胞在克隆动物、生产转基因动物、创建人类遗传疾病动物模型、研究细胞分化等领域具有广阔的应用前景。 本文用PCR方法克隆得到EGFP基因,通过酶切、连接、转化的方法构建了pSecTag-EGFP分泌型真核表达载体,用以研究pSecTag/HygroB真核表达载体转染鸡胚胎成纤维细胞的转染效率。设计优化试验,通过脂质体介导的方法转染鸡胚胎成纤维细胞,结果24h、48h后在荧光显微镜下能直接观察绿色荧光蛋白基因的表达。用Bradford检测法检测正交优化不同组合细胞培养液中所表达分泌的增强绿色荧光蛋白的相对含量。结果脂质体介导的方法能有效转染鸡胚胎成纤维细胞,利用SAS软件分析表明:蛋白表达相对含量与质粒的多少呈极显著正相关（P<0.01）,而与脂质体的量无显著相关性。并通过此实验结果,我们选出该质粒转染鸡胚胎成纤维细胞的最佳转染条件,即脂质体加2ul、质粒加1.0ug,从而为目的基因在鸡胚胎成纤维细胞中成功表达奠定了基础。 本文运用RT-PCR技术,克隆含信号肽和不含信号肽的小鼠分泌型白血病抑制因子cDNA,通过pBS-T载体和pMD18-T simple载体过渡,分别构建了含mLIF信号肽真核表达载体pSecTag-mlif（sp+）和不含mLIF信号肽真核表达载体pSecTag-mlif（sp-）,酶切进行初步鉴定。利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与构建表达载体中编码mLIF cDNA的同源序列,除在编码区216bp处碱基为G和在318bp处由G突变为T外,编码mLIF基因的其余序列与已发表的完全一致。运用DNAMAN软件对翻译水平进行预测,结果发现这一突变位点并不影响蛋白的翻译。用脂质体转染法分别将分泌型真核表达载体pSecTag-mlif（sp+）和pSecTag-mlif（sp-）转染鸡胚胎成纤维细胞,48h后收集细胞上清液,用PEG包埋浓缩,取一部分浓缩液做ELISA,一部分浓缩液做western-blot,结果表明pSecTag-mlif（sp+）和pSecTag-mlif（sp-）两个分泌型表达载体转染鸡胚胎成纤维细胞均有mLIF蛋白的表达。但pSecTag-mlif（sp+）在鸡胚胎成纤维细胞中蛋白表达水平明