喜树碱-20（s）-O-［N-（3’a，12’a-二羟基-24’-羰基-5’β-单胆酸）］-赖氨酸诱导SMMC-7721细胞凋亡机制的初步研究

论文摘要

本文主要研究新型喜树碱胆酸衍生物喜树碱-20（s）-0-[N-（3’α,12’α-二羟基-24’-羰基-5’β-胆酸）]-赖氨酸（B2）诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡发生的作用机制。为了降低喜树碱及其衍生物的毒性,增强其靶向性和生物利用度,我们研究了不同胆酸取代基在喜树碱不同取代位置对肝靶向能力的影响。在前期实验工作的基础上,我们发现在众多衍生物中B2体外作用效果最显著,且在较低浓度时仍具有良好的体内肿瘤抑制作用,具有一定的开发前景。本论文主要运用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜以及蛋白质电泳技术等实验方法重点研究了B2对人肝癌细胞SMMC-7721的凋亡诱导作用。研究结果如下：运用MTT法研究B2对人肿瘤细胞的生长抑制作用,研究表明B2对人肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7402以及人结肠癌细胞HCT-116均有不同程度的影响,与阳性对照组相比,对SMMC-7721的细胞毒作用最为明显,从时间梯度和浓度梯度来看,B2对SMMC-7721有显著的生长抑制作用,0.4nM B2作用细胞48h后,41.26%±2.82%的肿瘤细胞被杀死。利用激光共聚焦显微镜（LSCM）对SMMC-7721细胞形态学的改变进行观察,结果表明0.5nM B2作用SMMC-7721细胞48h后,细胞形态发生明显的改变,细胞核皱缩且边缘化,产生明显的凋亡小体。利用流式细胞仪分析B2作用SMMC-7721细胞后对细胞周期和凋亡的影响。不同药物浓度作用SMMC-7721细胞48h后,细胞周期分布发生了改变。随着药物浓度的不断增加,G1期细胞不断减少,S期和G2M期细胞不断增加,这表明细胞周期被阻断在S期和G2M期。同时凋亡结果显示,B2作用SMMC-7721细胞后,细胞凋亡率逐渐增加且呈现一定的浓度依赖性。利用流式细胞仪采用Fluo-3AM染色法检测B2诱导SMMC-7721细胞内Ca2+含量的变化,随着B2浓度的增加,细胞内Ca2+的含量也逐渐增加；采用罗丹明123（Rh123）染色法检测B2诱导SMMC-7721细胞线粒体膜电位（ΔΨm）的改变,结果显示在一定浓度范围内B2导致SMMC-7721细胞线粒体膜电位的下降；采用荧光探针DCFH-DA标记法检测B2诱导SMMC-7721细胞凋亡后细胞内活性氧（ROS）的改变,结果表明,随着B2浓度的增加,肿瘤细胞内的ROS含量也增加。采用分光光度法通过酶标仪检测B2作用SMMC-7721细胞后,细胞中caspase-3和caspase-9的变化。结果表明,B2在诱导肝癌细胞凋亡的过程中激活了caspase-3和caspase-9。Western-blot法分析了B2作用SMMC-7721细胞后Bcl-2和Bax蛋白水平的变化。检测结果显示B2下调了Bcl-2蛋白的表达,上调了Bax蛋白的表达,诱导细胞调亡。本文通过体外实验证明B2具有很好的抗肿瘤活性,通过形态学、周期以及凋亡等实验验证了B2抗肿瘤活性是通过诱导SMMC-7721细胞凋亡实现的,同时从分子水平上进一步阐述了B2诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 恶性肿瘤概况
• 1.1.2 恶性肿瘤的治疗方法
• 1.1.3 抗肿瘤植物药的研究进展
• 1.1.4 喜树碱及其衍生物抗肿瘤活性的研究
• 1.2 胆酸的概况
• 1.3 细胞凋亡
• 1.3.1 细胞凋亡的简介
• 1.3.2 细胞凋亡的生物学特征
• 1.3.3 细胞凋亡的信号通路
• 1.3.4 细胞凋亡与肿瘤
• 1.4 立题依据
• 2 B2体外抗肿瘤活性研究
• 2.1 实验仪器与材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 实验材料
• 2.1.4 实验前准备
• 2.1.5 主要试剂的配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 MTT法检测B2对肿瘤细胞的体外抑制作用
• 2.2.3 B2作用于SMMC-7721细胞形态学观察
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 B2对人肿瘤细胞的生长抑制作用
• 2.3.2 LSCM观察细胞形态学结果
• 2.4 本章小结
• 3 B2诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用机制
• 3.1 实验仪器与材料
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 实验试剂与材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 B2对SMMC-7721细胞周期分布的影响
• 3.2.2 B2对SMMC-7721细胞凋亡率的影响
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 B2诱导SMMC-7721细胞周期分布结果
• 3.3.2 B2诱导SMMC-7721细胞凋亡结果
• 3.4 本章小结
• 4 B2诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制研究
• 4.1 实验仪器与材料
• 4.1.1 主要仪器
• 4.1.2 实验材料
• 4.1.3 主要试剂配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 B2对SMMC-7721细胞线粒体膜电位（ΔΨm）的影响
• 2+含量的影响'>4.2.2 B2对SMMC-7721细胞内Ca²⁺含量的影响
• 4.2.3 B2对SMMC-7721细胞内ROS含量的影响
• 4.2.4 caspase-3和caspase-9活性检测
• 4.2.5 Western分析B2对Bcl-2及Bax蛋白表达的影响
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 B2对SMMC-7721细胞中ΔΨm的影响结果
• 2+含量变化结果'>4.3.2 B2诱导SMMC-7721细胞内Ca²⁺含量变化结果
• 4.3.3 B2诱导SMMC-7721细胞内ROS的改变
• 4.3.4 caspase-3和caspase-9活性的改变
• 4.3.5 Western-Blot检测结果
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢