转sb401基因水稻T4后代分析及水稻极度分蘖基因ext-M1b的遗传定位

论文摘要

水稻是我国的主要粮食作物之一。随着水稻在产量、抗性等方面研究的深入,人们越来越多关注稻米品质的提高。蛋白质、氨基酸的含量就是品质的一个重要指标。但在食用精米中,蛋白质平均含量仅为6.3%～7.1%,是谷类作物中最低的。其赖氨酸含量仅为0.22%～0.28%,为第一位限制性氨基酸。利用转基因技术改良稻米品质成为了一种重要的手段,怎样获得外源基因稳定表达、遗传的材料成为了研究的热点。热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlacePCR,TAIL-PCR）是由刘耀光等发明,由于其广泛的优点,迅速成为了反向遗传学研究的重要方法。同时,也为转基因植物外源基因的研究提供了一个重要的手段。本研究以通过农杆菌介导法获得的转sb401基因的粳稻日本晴为材料,采用Southern杂交、TAIL-PCR法及种子总蛋白质、赖氨酸含量测定等系统地分析了不同转化事件获得的转基因株系后代外源基因整合位点和表达规律。其主要的研究结果如下:1.对获得的10株转sb401基因水稻后代进行逐代检测选留,获得了九个独立的T4代纯合转基因株系。2.对独立的转基因株系进行Southern blotting分析,结果发现,除阴性对照未出现杂交条带外,其余的10个转基因株系分别出现1～3条明显的杂交条带,且外源基因的整合位点是不同的,这一结果表明,农杆菌介导转化的外源基因大多以单拷贝或低拷贝整合到受体基因组中。3.对检测纯合的九个独立转基因株系的T-DNA进行了TAIL-PCR分析,通过对扩增片段的克隆测序,得到了8个含日本晴基因组序列的侧翼片段,分别将其定位于日本晴的七条染色体上。结果和Southern一样表明,基因的整合位点是不同的。其中的两个株的侧翼序列系通过TAIL-PCR的步移扩增才得到,也证实了T-DNA的非典型整合方式的存在。4.对9个独立转基因株系和一份非转基因日本晴对照进行蛋白质氨基酸检测。结果发现,所有9个株系中总蛋白含量增量为2.7%～18.4%,氨基酸总量增量为2.3%～15.8%,而赖氨酸含量增量为0%～10%,表明富赖氨酸蛋白基因sb401在所检测的转基因株系中（除LK3外）均有表达。分析还显示,各转基因株系的总蛋白质含量、氨基酸总量的增加与赖氨酸的增加并不完全成正比。表明sb401基因对多个氨基酸组分都有增加作用。5.结合Southern blotting、TAIL-PCR和蛋白质、氨基酸及赖氨酸的测定分析发现,在低拷贝的情况下,各株系的表达量差异不十分明显。同时,讨论了整合位点和拷贝数与表达量的关系。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,世界上半数以上的人口以水稻为主食。分蘖是影响水稻与小麦等主要农作物穗数多少并进而影响单产的重要农艺性状之一;分蘖又是单子叶植物在生长发育过程中形成的一种特殊的分枝特性,具有重要的发育生物学特性。因此,对水稻分蘖的研究具有重要的理论意义和应用价值。通过对相关突变体的研究,人们已获得关于水稻分蘖的一些知识。为了研究水稻分蘖发生的复杂机制,迫切需要寻找和筛选出各种类型的突变体,以便分离出相应的突变基因,进而研究这些基因控制水稻分蘖的机制。从水稻保持系绵香1B（M1B）和一份雄性核不育材料（Genetic Male Sterile,GMS-1）的杂交F2代中发现一株极度分蘖突变体（分蘖数达121）,命名为M1B-ext。用突变体与正常分蘖和植株形态的水稻品种2480B、D62B、G46B、G683B、M1B进行正反交配制杂交组合构建F2群体。对所配制的杂交组合进行遗传分析。无论正交还是反交,所有组合F1代株系均表性为正常亲本的表型。根据F2代表型及X2测验表明,正常植株与突变体的比例符合一对基因控制的分离比3:1,表明该突变性状受单隐性核基因控制。同时,极度分蘖性状与株高变矮共分离,据此推测突变体M1B-ext极度分蘖特性与株高矮化现象可能受同一隐性基因控制的一因多效或紧密连锁。选取符合度高且群体较大的2480B/M1B-ext的F2代分离群体作定位群体。它包括602个隐性单株和1865个显性单株,进行连锁分析。找到4个连锁标记LKW3、LKW34、LKW97和LKW84,用MAPMAKER软件进行连锁分析,构建ext-M1B极度分蘖基因的局部分子连锁图。结果表明,该极度分蘖基因位于水稻第6染色体短臂,其遗传距离分别为:5.0cM、1.2 cM、3.8 cM和5.1cM。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 转高赖氨酸蛋白质基因（SB401）水稻T4后代分析
• Ⅰ 文献综述
• 1 稻米营养品质及其遗传改良现状概述
• 1.1 稻米营养品质性状的组成
• 1.2 蛋白质的种类及其含量
• 1.3 蛋白质的氨基酸组成及其营养价值
• 1.4 其它营养成分
• 2 传统育种方法对水稻营养品质改良的局限
• 3 基因工程对稻米品质的改良进展
• 3.1 增加稻米中赖氨酸和蛋白质的含量
• 3.2 增加稻米中维生素的含量和种类
• 3.3 增加稻米中微量矿质营养元素铁的含量
• 3.4 淀粉合成的调节
• 4 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 4.1 根瘤农杆菌简介
• 4.1.1 T-DNA区（transferred-DNA regions）
• 4.1.2 Vir区（virulence region）
• 4.1.3 Con区（regions encoding conjugations）
• 4.1.4 Ori区（regions of replication）
• 4.2 农杆菌转化植物细胞的机理
• 5 T-DNA整合的机理及特征
• 5.1 T-DNA的整合机理
• 5.2 T-DNA整合位点及其特性
• 5.3 T-DNA整合的复杂结构
• 6 外源目的基因的遗传学行为
• 6.1 质粒DNA在转基因植株中的存在形式
• 6.2 外源基因在转基因后代中的遗传行为
• 7 基因沉默与失活
• 7.1 转录水平的基因沉默（Transcriptional Gene Silencing,TGS）
• 7.1.1 DNA甲基化修饰
• 7.1.2 插入拷贝数
• 7.1.3 反式失活
• 7.1.4 插入位点效应
• 7.1.5 后成修饰
• 7.2 转录后水平的基因沉默（Post Transcriptional Gene Silencing,PTGS）
• 8 获得基因侧翼序列位点信息的几种扩增方法
• 8.1 质粒拯救（plasmid rescue）法
• 8.2 反向PCR（inverse or invertedPCR,IPCR）法
• 8.3 热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）
• 8.4 PCR-walking
• 8.5 Sequence-based分离法
• 8.6 突变位点扩增法（Amplification of insertion mutagenised sites,AIMS）
• 8.7 连接介导PCR（Ligation—mediated PCR,LMPCR）
• 9 立题思想
• Ⅱ 材料与方法
• 1 水稻及转化载体
• 1.1 水稻转基因株系
• 1.2 转化载体
• 2 实验方法
• 2.1 转基因植株的PCR检测
• 2.1.1 水稻DNA的提取
• 2.1.2 潮霉素抗性基因的检测
• 2.2 转基因T4后代的Southern blotting分析
• 2.2.1 大量法提取水稻基因组DNA
• 2.2.2 DNA限制性酶解
• 2.2.3 凝胶电泳
• 2.2.4 对电泳后凝胶的处理
• 2.2.5 毛细管印迹
• 2.2.6 预杂交
• 2.2.7 标记探针
• 2.2.8 杂交
• 2.2.9 洗膜
• 2.2.10 显影
• 2.3 转基因植株T-DNA侧翼序列的TAIL-PCR分析
• 2.3.1 扩增的特异引物与简并引物
• 2.3.2 TAIL-PCR的反应体系及循环
• 2.3.3 PCR产物的纯化回收
• 2.3.4 PCR产物的克隆测序
• 2.4 转基因植株各株系成熟种子总蛋白、氨基酸总量、赖氨酸含量的测定
• Ⅲ 结果与分析
• 1 各转基因株系的PCR检测
• 2 各转基因株系的SOUTHERN BLOTTING分析
• 3 转基因株系T-DNA侧翼序列分析
• 4 SB401基因在转基因株系成熟种子中的表达
• Ⅳ 讨论
• 第二部分 水稻极度分蘖基因EXT-M1B的遗传定位
• Ⅰ 文献综述
• 1 植物分枝的研究
• 2 水稻分蘖及其遗传研究进展
• 2.1 水稻分蘖
• 2.2 分蘖的遗传研究进展
• 3 立题思想
• Ⅱ 材料与方法
• 1 遗传学分析及定位群体材料
• 2 实验方法
• 2.1 遗传学分析
• 2.2 水稻叶片总DNA的提取（参见第一部分实验方法2.1.1）
• 2.3 连锁分析
• 2.3.1 反应体系和反应程序
• 2.3.2 琼脂糖电泳检测
• 2.4 数据处理
• Ⅲ 结果与分析
• 1 突变体的来源及表型分析
• 2 EXT-M1B基因的遗传定位
• 2.1 遗传分析
• 2.2 连锁分析
• Ⅳ 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文目录