论文摘要
为了完善刺参病害发生的理论和探讨生态防治的方法,本文利用常规技术从患病仿刺参中分离了致病菌,并初步分析了其致病性；此外,模拟刺参养殖环境,测定了感染病菌后刺参相关非特异性免疫指标的变化；利用病菌感染刺参构建的cDNA文库进行EST分析,并鉴定了若干免疫相关基因；筛选了病原菌的拮抗菌,并对其拮抗特性进行了研究。试验结果如下：采用微生物学方法鉴定了假交替单胞菌属2株细菌和1株病毒,其中病菌Pseudoalteromonas sp和病毒粒子对刺参有较强的感染性和致病性。实验表明,随着病原菌感染浓度升高,刺参体腔液溶菌酶活性和AKP活性、SOD和CAT及PO的诱导活性、补体C3含量和呼吸爆发活性均显著下降,而体腔液ACP活性和补体C4含量稍微上升；刺参体表粘液的SOD活性和溶菌酶活性对病菌感染较敏感,含量明显受到抑制；而体表粘液中的CAT活性、ACP活性和补体C4含量在病原菌感染浓度较低时增加、在感染浓度较高时减少。病毒感染条件下,刺参体液中的溶菌酶、酸性磷酸酶、SOD和PO活性降低,而CAT活性增强,体腔液中的免疫酶活性比体表粘液中的免疫酶活性变化更明显。当水体中氨氮浓度较高时,刺参体腔液中的超氧物歧化酶（SOD）和碱性磷酸酶（ALP）活性降低、溶菌酶（LSZ）活性升高；而在感染病菌的情况下,体腔液SOD、ALP和LSZ活性下降,而GPx活性持续上升；在中等氨氮浓度时,体腔液酶活性减少幅度最小或增加幅度最大。硒可诱导动物的抗病毒和抗病菌活性,亚硒酸钠浓度较低时,随着亚硒酸钠浓度增加,刺参体液超氧物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GP、）、溶菌酶（LSZ）、酚氧化酶（PO）和碱性磷酸酶（ALP）活性升高；而在感染病原菌的情况下,体液SOD、GPX和LYZ的活性表现为先升高后下降的趋势,PO和ALP的活性则持续上升。在高浓度NO2-条件下,刺参体腔液SOD、CAT、AKP和P0的诱导活性下降,LSZ和GPx活性显著被抑制；病原菌感染时加剧刺参体腔液CAT、GPx、LSZ和P0活性被抑制,但体腔液SOD活性被诱导升高；缺氧处理刺参时,体腔液ACP诱导活性被抑制,而AKP活性被促进；分析表明,病原菌感染可促进体腔液ACP诱导活性,明显拮抗高浓度NO2-对AKP活性的抑制。在较低的适宜盐度条件下,病原菌感染可促进刺参体液SOD、GPx和AKP活性的诱导水平,而盐度过高时,病原菌感染加剧使刺参体液SOD、GPx和AKP活性水平降低；此外,适宜盐度处理下,刺参体液LSZ活性均可被诱导,而病原菌感染后,体液LSZ的诱导活性被抑制。水温低于23℃时,升温和病原菌感染均可促进刺参体液SOD、GPx、LSZ和P0的活性；高温胁迫条件下,病原菌感染可明显抑制体液上述酶的活性；此外,水温上升可抑制刺参体液AKP活性,而病原菌感染诱导AKP活性。缓慢升高温度可以增强刺参体液的SOD和PO活性,但体液GPx和LSZ活性变化不大,而高温预处理后刺参体液SOD和LSZ活性明显下降；因此,适当的温度刺激可减少刺参的发病。构建的cDNA文库库容为3.24×105cfu/mL,插入片段大小为0.8-2.5kb,文库质量较高。对文库进行测序和初步的生物信息学处理,得到了高质量的表达序列标签（ESTs）1106条。经过软件拼接,共得到533条单基因簇,包含165个序列重叠群和368条单一序列。同源序列基因分析表明,仿刺参cDNA文库中有25种免疫相关的基因。采用real-time PCR技术对免疫相关基因进行分析,证明了体腔液中血清凝集素、补体C3和补体3类似蛋白基因的表达水平显著升高,提示其在刺参免疫防御中发挥作用。为了开发更多有效的病原拮抗菌用于刺参疾病防治,本文利用点种法和滤纸片法筛选到了5株拮抗菌,利用牛津杯法进一步确认YAAJ6和YASM12拮抗菌株的活性最高。活体试验表明,该2株拮抗菌是通过促进体腔液SOD、ALP、LSZ活性和细胞吞噬活性而提高刺参对病原菌的抗性。深入的研究表明,拮抗菌胞外产物在28℃或pH8.0时抑菌活性最高,但对蛋白酶K和链霉素蛋白酶敏感。本研究证实,病原细菌和病毒病原均可导致刺参非特异性免疫力的下降；水环境的变化会加剧刺参受病原菌感染的可能性,但适宜的环境条件可诱导刺参免疫反应；水温驯化处理可一定程度提高刺参的免疫能力；筛选有效拮抗菌并加以应用,是刺参病害防治的有效手段之一。